产气荚膜梭菌四联外毒素基因α-β2-ε-β1在重组干酪乳酸杆菌表达及遗传稳定性分析

摘要

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，C.perfringens）是革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界中，是引起人和动物多种疾病的病原菌，常见于肠道感染，如食物中毒、坏死性肠炎、创伤性气性坏疽及肠毒血症等。其中，外毒素是产气荚膜梭菌的主要致病因子，包括α、β、ε和ι毒素，以α、β、ε毒素常见。基于产气荚膜梭菌的危害性及其病原菌和毒素经肠道感染和吸收等特点，本研究以益生性干酪乳杆菌作为免疫原传递的活菌载体，以EGFP为筛选标记，构建非抗性标记的融合表达产气荚膜梭菌α、β2、ε和β1外毒素的重组干酪乳酸杆菌系统，以期为各型产气荚膜梭菌病免疫预防提供重要得物质基础。
　　将编码产气荚膜梭菌α、β2、ε和β1毒素的基因进行融合（α-β2-ε-β1），定向插入至乳酸杆菌组成型表面表达载体pPG-T7g10-PPT，重组质粒命名为pPG-α-β2-ε-β1。然后，将编码增强型绿荧光蛋白(EGFP)基因连入重组质粒pPG-α-β2-ε-β1（位于目的基因α-β2-ε-β1前），构建了重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1。利用电转化方法将重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1转入Lactobacillus casei393中，获得了重组干酪乳酸杆菌pPG-E-α-β2-ε-β1/L.casei393。当pPG-E-α-β2-ε-β1/L.casei393重组菌传至3～4代后，其中的目的基因α-β2-ε-β1发生缺失突变，经PCR、酶切鉴定及测序分析发现，目的基因由α-β2-ε-β1变为α-β1、β2和ε基因发生遗传缺失，而将重组菌连续传代培养50代时，缺失变短后的目的基因α-β1可以稳定遗传。将重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1在大肠杆菌TG1中连续传50代，结果未发现目的基因缺失，说明目的基因遗传缺失与宿主菌相关。
　　通过对融合基因α-β2-ε-β1的基因序列分析，发现目的基因之间的连接采用了相同的linker编码基因序列(GPGPYV)，由此推测linker的使用可能是导致目的基因在干酪乳酸杆菌中遗传不稳定性的因素。为验证这一推测，将编码产气荚膜梭菌α、β32、ε和β1外毒素的基因采用不同linker进行串联，克隆至表达载体pPG-T7g10-PPT，通过电转化方法重新构建了以EGFP为筛选标记的重组干酪乳酸杆pPG-E-α-β2-ε-β31'/L.casei393。实验结果显示，将重组干酪乳酸杆菌pPG-E-α-β2-ε-β1'/L.casei393连续传代培养，目的基因未发生遗传缺失;经Western blot方法鉴定融合蛋白获得了表达，分子量大小约196kDa;经激光共聚焦及流式细胞术分析显示，融合绿荧光的蛋白能够稳定表达于干酪乳酸杆菌菌体表面。
　　综上所述，linker序列的重复使用可造成外源融合基因在重组乳酸杆菌中的遗传缺失，该现象的发现对乳酸杆菌表达系统的构建、基因工程乳酸杆菌活载体疫苗的研制具有指导作用。同时，本研究构建的以EGFP为筛选标记的重组干酪乳酸杆菌系统为产气荚膜梭菌多价亚单位疫苗的研制提供了物质基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 乳酸杆菌表达系统的研究进展

1．2 产气荚膜梭菌及其毒素研究进展

1．2．1 α毒素

1．2．2 β毒素

1．2．3 ε毒素

1．3 Linker研究进展

1．3．1 基因融合技术

1．3．2 Linker的选择原则与功能

1．3．3 Linker的类型

1．4 绿色荧光蛋白研究进展

1．5 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 质粒和菌种

2．1．2 引物

2．1．3 生化试剂及试剂盒

2．1．4 抗体

2．1．5 主要实验仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1的构建

2．2．2 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1在乳酸杆菌中遗传稳定性分析

2．2．3 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1’的构建

2．2．4 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1’在乳酸杆菌中遗传稳定性分析

2．2．5 重组乳酸杆菌pPG-E-α-β2-ε-β1’／L．casei 393的蛋白表达及鉴定

3 结果

3．1 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1的构建

3．1．1 重组质粒pMD19-T-α-β2-ε-β1酶切鉴定结果

3．1．2 重组质粒pPG-α-β2-ε-β1的鉴定结果

3．1．3 重组质粒pMD19-T-EGFP的鉴定结果

3．1．4 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1的酶切鉴定结果

3．2 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1遗传稳定性鉴定

3．2．1 阳性重组乳酸杆菌中pPG-E-α-β2-ε-β1的鉴定结果

3．2．2 大肠杆菌pPG-E-α-β2-ε-β1／TG1连续传代PCR鉴定结果

3．2．3 乳酸杆菌pPG-E-α-β2-ε-β1／L．casei 393连续传代PCR鉴定结果

3．2．4 乳酸杆菌pPG-E-α-β2-ε-β1／L．casei 393连续传代酶切鉴定结果

3．2．5 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1遗传稳定性测序结果

3．3 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1’的构建结果

3．3．1 质粒pMD19-T-α-β2、pMD19-T-ε、pMD19-T-β1酶切鉴定结果

3．3．2 重组质粒pMD19-T-α-β2-ε酶切鉴定结果

3．3．3 重组质粒pMD19-T-α-β2-ε-β1’酶切鉴定结果

3．3．4 重组质粒pPG-α-β2-ε-β1’酶切鉴定结果

3．3．5 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1’酶切鉴定结果

3．4 重组乳酸杆菌pPG-E-α-β2-ε-β1’／L．casei 393遗传稳定性鉴定

3．4．1 重组乳酸杆菌pPG-E-α-β2-ε-β1’／L．casei 393 PCR鉴定结果

3．4．2 重组乳酸杆菌pPG-E-α-β2-ε-β1’／L．casei 393酶切鉴定结果

3．4．3 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1’遗传稳定性测序结果

3．5 重组乳酸杆菌pPG-E-α-β2-ε-β1’／L．casei 393蛋白表达及鉴定

3．5．1 激光共聚焦显微镜检测结果

3．5．2 Western blot鉴定结果

4 讨论

4．1 不同linker对外源基因遗传的稳定性影响

4．2 EGFP基因作为报告基因的优点及其应用

4．3 乳酸杆菌感受态制备及电转化分析

4．4 重组质粒pPG-E-α-β2-ε-β1在不同菌中的遗传稳定性

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文