低温保存蓝狐精液中精子活率及质膜、顶体的完整性检测

摘要

目前，狐人工授精技术作为养狐业的一项重大技术，在引进芬兰蓝狐改良我国现有蓝狐品质的过程中，已愈来愈被广大养狐者所重视。随着人工授精技术的不断开展，精液的体外保存就显得十分重要。目前生产中主要使用鲜精进行人工授精，受孕率也比较理想，但精子的存活时间短，使优良的种狐资源难以得到充分利用，造成一些优良精液的浪费。由于精子解冻后的低成活率和人工授精后的低繁殖率，使得蓝狐精液冷冻技术难以得到推广。精液的低温保存可以减少冷冻对精子的损伤，而且存活时间比常温时明显延长，可用于人工授精。但随着体外保存时间的延长，精子的受精能力会逐渐降低。所以，蓝狐精液低温保存及保存时精子质量的评价就显得非常重要。 本研究对蓝狐精液用IVT(Ⅰ)、氨基乙酸(Ⅱ)、卵黄-牛奶(Ⅲ)、葡萄糖-卵黄(Ⅳ)四种低温稀释液稀释保存，在0～5℃保存5天的过程中对精子的质量从活率、质膜的完整性、顶体的完整性进行了检测，并用常温稀释液东林Ⅱ号进行了对照实验。利用伊红-苯胺黑检测精子的死活；利用低渗肿胀实验检测精子质膜的完整性；利用考马斯亮蓝染色检测精子顶体的状态。结果发现，低温保存时精子的活率、质膜的完整性、顶体的完整性明显比常温保存时比率高。伊红-苯胺黑染色和低渗肿胀实验两种方法检测精子的质量都很灵敏，前者的检测结果稍低，但都低于考马斯亮蓝染色法检测的顶体完整精子的比率。伊红-苯胺黑染色、低渗肿胀实验和考马斯亮蓝染色法检测结果高度相关(r≥0.9981)。四种不同的低温稀释剂保存的前2天，活精子的比例和质膜、顶体完整的精子的比例都缓慢减少，此后降低较快；常温稀释剂中的精子这三项指标在前12小时变化缓慢，以后变化较快。在保存的前8小时，常温稀释剂中保存的精子，活率、质膜的完整性及顶体的完整性都好于四种低温稀释剂。在第3天时五种稀释剂中活精子的比率分另为：48.81±3.21％(Ⅰ)、63.62±2.47％(Ⅱ)、42.10±2.68％(Ⅲ)、55.07±2.79％(Ⅳ)、14.60±1.85％(东林Ⅱ号)。第5天时，除了Ⅱ号稀释剂，其它稀释剂中精子的活率都在10％以下。低温稀释剂Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ在保存2天，Ⅱ号稀释剂在保存4天，常温稀释剂保存1天的精液中精子的活率、质膜的完整性及顶体的完整性仍都高于60％，可用于输精。四种低温稀释剂对精液的保存效果依次为：Ⅱ＞Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅲ，都好于常温稀释剂的保存效果。 此外，本实验还对9只蓝狐精液在低温保存和常温保存时精子的活力、存活时间和生存指数做了比较研究。结果发现，低温环境(0～5℃)能明显延长蓝狐精子体外存活的时间，复温后具有较高的活力。蓝狐精子体外常温保存时最长存活时间和生存指数分别为：50小时、27.4，平均存活时间和生存指数为：24.22小时、12.7；低温保存时最长存活时间和生存指数分别为：108小时、48.4，平均存活时间和生存指数为：37小时、17.89。蓝狐精液在常温保存时的存活时间、生存指数与低温保存时的存活时间和生存指数之间具有线性关系。蓝狐精液在低温保存和常温保存时存在着明显的个体差异和季节性差异。繁殖末期，蓝狐精液品质普遍下降，不宜做低温保存。

目录

文摘

英文文摘

1绪论

1.1人工授精技术的发展

1.1.1家畜人工授精技术的发展

1.1.2狐人工授精技术的发展

1.2精液体外保存的研究进展

1.2.1家畜精液体外保存的研究进展

1.2.2狐精液体外保存的研究进展

1.3膜结构和稀释剂成分对精子保存质量的影响

1.3.1精子质膜成分和组成在精液保存中对精子质量的影响

1.3.2稀释剂成分对精子质量的影响

1.4哺乳动物精子质量检测方法的研究进展

1.4.1染色质的结构

1.4.2质膜的完整性

1.4.3精子膜的去稳定

1.4.4线粒体的活性

1.4.5顶体的状态

1.4.6精卵之间的相互关系

1.4.7结语

1.5研究的目的和意义

2材料和方法

2.1仪器和试剂

2.2精液的采集和保存

2.3精子质量的检测

2.3.1精子活率的检测

2.3.2质膜完整性检测

2.3.3顶体状态的检测(考马斯亮蓝染色法)

2.3.4实验所用药品的配制

2.3.5数据统计分析

3结果

3.1利用不同稀释剂低温保存蓝狐精液精子质量检测

3.1.1伊红-苯胺黑染色法检测精子的活率

3.1 2低渗肿胀实验对精子质膜完整性的检测

3.1.3考马斯亮蓝染色法检测蓝狐精液中顶体完整精子的百分率

3.1.4蓝狐精液在不同稀释剂保存下不同方法间的相关系数

3.2蓝狐精液低温保存与常温保存时精子的总存活时间和生存指数的比较

3.2.1蓝狐精液低温保存和常温保存的存活时间及二者的关系

3.2.2蓝狐精液低温保存和常温保存的生存指数及二者的关系

4讨论

4.1利用不同稀释剂低温保存蓝狐精液精子质量检测

4.2蓝狐精液低温保存与常温保存时精子的活力、总的存活时间和生存指数的比较

5结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

独创性声明和学位论文版权使用授权书