内毒素休克小鼠肝脏细胞质磷酸化蛋白质组学的研究

摘要

脓毒症(sepsis)是感染引起的全身炎症反应征候群，其严重并发症——感染性休克(septic shock)是创伤、烧伤和手术后病人最主要的死亡原因之一。统计表明，临床半数的脓毒症是由于革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)感染引起的，革兰氏阴性菌的细胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，或称为内毒素(endotoxin)，被认为是革兰氏阴性菌引起脓毒症的主要作用分子。LPS广泛作用于机体多种组织器官，其中内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞是最主要的效应细胞，在LPS的刺激下，它们产生大量的细胞因子，即“细胞因子风暴”(cytokine storm)，进而引起失控性的炎症级联反应，最终引起内毒素休克、组织损伤和多器官功能障碍(mutiple organ dysfunction，MOD)。因此，脓毒症或内毒素休克(endotoxic shock)的分子机制的研究大多集中在内皮、巨噬细胞和中性粒细胞上，而在其它组织和器官上的相对研究较少。
　　肝脏是人体代谢的枢纽，也是重要的免疫器官，血液中大量蛋白也是由肝脏合成分泌的。在脓毒症的炎性应激刺激下，肝脏可以大量合成并分泌急性期蛋白(acute phaseprotein，AP)，如C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、α1-蛋白酶抑制剂(alpha1-proteinase inhibitor)、结合珠蛋白(haptoglobin)、纤维蛋白原(fibrinogen)及补体(complement)等，可以启动迅速的机体防御机制。然而肝脏对病原微生物或其毒性产物产生什么样的反应？脓毒症或感染性休克发生发展进程中肝脏自身变化如何？肝脏通过什么样的分子调控机制调控多种炎症相关反应蛋白的表达？对于这些问题，目前所知有限。然而，对这些问题的解答，对于了解错综复杂的脓毒症及其感染性休克的发病机制无疑是有益的。
　　LPS信号转导通路的启动是内毒素致病过程中的重要环节。细胞信号转导研究的中心问题就是细胞感受、转导环境刺激及调节代谢生理反应和基因表达的分子途径。磷酸化修饰本身所具有的简单(simplicity)、灵活(flexibility)、可逆(reversibility)的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段，蛋白质磷酸化在信号转导中所起的无可替代的作用已是人所共知的事实。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化，信号转导，细胞凋亡、神经活动，肌肉收缩，肿瘤发生等过程在内的所有生命活动，目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。那么，内毒素休克早期细胞质发生了哪些功能事件？其具体分子机制如何？目前所知甚少。因此，进行内毒素休克时肝脏细胞细胞质中大规模磷酸化蛋白质组学分析对研究内毒素休克的发生发展机制是十分重要的。
　　以往的研究大多是在已有的工作基础上对少数几个细胞分子进行分析、在理论上推导出对疾病发生发展可能具有重要意义的分子，进而进行深入细致的功能研究。这是一种传统的研究策略，其优点是研究问题集中，容易深入，可以比较透彻地回答一个点上的问题，但是若将这个结果放到一个体系层面上，其功能又变得扑簌迷离，这是由“分析”主导的研究手段的局限所导致的，只有当这种“点”的结果积累得足够多的时候，体系的问题也会变得逐渐清晰起来，但这个过程一般需要长时间的积累。而蛋白质组是高度动态的，即使同一细胞在不同生理或病理环境中，其蛋白表达也是不同的，这种差异蛋白往往是某些疾病发生的标志。利用比较蛋白质组研究技术，可以批量观察正常与疾病细胞（组织）在蛋白质表达谱上的差异，从整体水平上规模化地筛选和发掘潜在的药物标靶，以及适用于早期诊断、介入和治疗的疾病蛋白标志物。但蛋白的功能仅仅从量的变化上分析往往会限制我们的研究视野，很多重要蛋白质的活性是由翻译后修饰调节的，有时蛋白水平上看不到明显变化但翻译后修饰水平已有显著变化。因此采用定量技术对内毒素刺激前后小鼠肝脏细胞质磷酸化蛋白质组学进行差异定量分析，寻找一批与内毒素休克肝损伤的发生发展紧密相关的高特异性和灵敏性的生物标记物是非常有价值的。
　　由于蛋白质组学研究具有大规模、高通量、高灵敏度的特点，因此可以有效分析细胞内的整体蛋白质。然而整个细胞或组织的蛋白组成极其复杂，直接对其进行蛋白质组学分析，往往会丢掉很多蛋白质信息，由此衍生出了亚细胞蛋白质组学。亚细胞蛋白质组就是利用蛋白质组学研究技术来分析一种组织或细胞的某一亚细胞结构内的蛋白质组成，它一方面可以降低样品的复杂度，使分析简单化;另一方面可以相对富集相应亚细胞结构的低丰度蛋白，并且可以部分提示蛋白质的定位和功能信息。国外已有亚细胞蛋白质组方面的研究报道，并向纵深发展，出现了亚细胞器蛋白质组和复合体蛋白质组;但目前关于内毒素休克过程中肝脏细胞质蛋白的亚细胞蛋白质组研究国内外未见报道。
　　荧光差异凝胶电泳(fluorescence differential gel electrophoresis，DIGE)是一种在2-DE电泳之前进行荧光染料标记蛋白样品的方法，通过对不同的蛋白样品用不同的荧光染料进行标记，在同一块双向凝胶中可同时分离多至三种不同的蛋白样品，并且每块胶上又引用了内标，内标的利用进一步增加可信度，确保结果能反映出真实的生物学差异，避免了系统误差实验结果的影响，从而能够对样品间蛋白质丰度差异进行精确分析。DIGE系统最大的优点就是整合了CyDye染料多重标记方法与DeCyde差异分析软件的优势。DeCyder差异分析软件利用了共找点检测的算法，能对荧光图像进行自动检测、背景消除、定量、归一化以及凝胶内匹配，避免了人为因素的影响，消除了不同操作者带来的系统误差。
　　基于上述思考，我们利用LPS来制作内毒素休克BALB/c小鼠模型，采用差速离心结合蔗糖密度梯度离心提取和纯化了正常组和LPS刺激1h后的小鼠肝脏细胞质蛋白并利用金属磷酸盐亲和层析树脂富集磷酸化蛋白后，采用DIGE技术对两组磷酸化蛋白进行分离，并建立了相应的差异蛋白图谱。通过DeCyder差异分析软件分析后找到差异蛋白点37个，表达上调的有23个，表达下调的有14个。对这些差异蛋白点利用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行蛋白质鉴定，共鉴定出28种蛋白质。对鉴定的28种蛋白质进行检索，发现有19种蛋白为确证的磷酸化蛋白质。
　　通过对鉴定的蛋白质作亚细胞定位预测分析，我们发现有2个蛋白定位于细胞骨架;既可定位于细胞质内，又可定位于其它多个亚细胞结构的有20个;在其它亚细胞结构定位，但是没有定位于细胞质的有6个。通过定位预测分析后，我们又对蛋白质进行功能分析，并结合相关文献，发现这些差异蛋白功能涉及分子伴侣、氧化还原酶、抗凋亡蛋白、细胞周期蛋白、细胞骨架蛋白等。此外，采用String数据库和软件对所鉴定蛋白质的相互作用进行分析，发现其中8种蛋白具有直接或间接的相互作用，它们构成一张相互作用网络图。
　　通过研究，我们得出以下几点结论:
　　1.差速离心法结合密度梯度离心法是提取肝脏细胞细胞质的有效方法。
　　2.应用金属磷酸盐亲和层析树脂成功富集了细胞质磷酸化蛋白并利用2D DIGE分离技术分离了正常和内毒素休克BALB/c小鼠(LPS1h)的肝细胞细胞质磷酸化蛋白，并建立了相应的差异蛋白图谱。通过相应的软件分析，得到了37个具有统计学意义的差异蛋白点。
　　3.对37个差异蛋白点进行质谱鉴定，去除角蛋白污染和重复蛋白后，共鉴定出28种蛋白，其中19种蛋白是确证的磷酸化蛋白质。
　　4.对28种差异蛋白进行亚细胞定位分析发现，2个蛋白定位于细胞骨架;既可定位于细胞质内，又可定位于其它多个亚细胞结构的有20个;在其它亚细胞结构定位，但是没有定位于细胞质的有6个。
　　5.通过生物信息学分析发现这些差异蛋白功能涉及分子伴侣、氧化还原酶、抗凋亡蛋白、细胞周期蛋白、细胞骨架蛋白等。而且发现28种蛋白中有8种蛋白有直接或间接的联系，构成一张相互作用网络图。

目录

摘要

1 绪论

1．1 脓毒症

1．2 蛋白质的磷酸化修饰

1．2．1 磷酸化修饰的特点

1．2．2 磷酸化修饰的研究现状

1．3 蛋白质组学新技术

1．3．1 荧光差异凝胶电泳

1．3．2 多维LC-MSMS技术

1．3．3 稳定同位素标记

1．3．4 生物芯片(Biochips)

1．3．5 表面等离子体共振—生物分子相互作用

1．4 技术路线

2 内毒素休克小鼠肝脏细胞质的分离

2．1 材料

2．1．1 配制试剂

2．1．2 主要试剂和试剂盒

2．1．3 实验动物

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 BALB／c小鼠内毒素休克模型的制备

2．2．2 肝脏组织细胞质的提取

2．2．3 肝脏组织细胞质的蛋白质定量

2．3 结果

2．3．1 蛋白质定量结果

2．4 本章小结

3 肝脏细胞质磷酸化蛋白的DIGE分离

3．1 材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．1．3 主要配置的试剂

3．2 方法

3．2．1 细胞质磷酸化蛋白质的富集

3．2．2 细胞质磷酸化蛋白的浓缩(丙酮沉淀)

3．2．3 细胞质磷酸化蛋白的除盐

3．2．4 细胞质磷酸化蛋白的WestBlot检测

3．2．5 细胞质磷酸化蛋白的差异点分析-DIGE

3．3 结果

3．3．1 细胞质磷酸化蛋白的WestBlot检测

3．3．2 双向凝胶电泳分离荧光标记蛋白的结果

3．3．3 荧光差异双向凝胶电泳蛋白图谱

3．3．4 制备胶图像

3．3．5 DeCyder软件分析差异性蛋白质点

3．4 本章小结

4 内毒素休克小鼠肝脏细胞质差异蛋白的鉴定和生物信息学分析

4．1 材料

4．1．1 主要试剂和耗材

4．1．2 主要仪器

4．1．3 主要配制的试剂

4．1．4 主要数据库和生物信息学网站

4．2 方法

4．2．1 DIGE分离蛋白样品质谱鉴定前的处理

4．2．2 质谱鉴定

4．2．3 生物信息学分析

4．3 结果

4．3．1 蛋白质的质谱鉴定

4．3．2 蛋白质的亚细胞定位分析

4．3．3 差异蛋白功能分析

4．3．4 差异蛋白形成复合物分析

4．4 讨论

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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