鸡骨胶原蛋白肽的酶法制备及其抗氧化性研究

摘要

鸡骨含有丰富的营养成分，特别是胶原蛋白含量较高。本研究是以鲜鸡骨为原料，提取其中的胶原蛋白成分，采用双酶水解方式制备出胶原多肽，并研究其在生物体内、体外不同抗氧化体系中的抗氧化活性。
　　首先，研究了胶原蛋白的最佳提取工艺。研究表明，4％的盐酸浸酸10h，可脱除原料鸡骨中96.38％的钙盐;0.1％的Ca(OH)2浸灰24小时，可浸出非胶原蛋白成分，使胶原蛋白纯度提高1.41％;加热熬煮的温度为100℃，时间5h。此实验条件下，得到产物鸡骨胶的残留灰分为2.27％，蛋白质含量88.75％，其中胶原蛋白含量为86.02％。
　　其次，确定了采用Alcalase碱性蛋白酶及Flavourzyme复合风味蛋白酶双酶分步水解法制备鸡骨胶原多肽生产工艺条件。以水解度为指标，Alcalase碱性蛋白酶最佳水解条件为:加酶量:7000U/g;酶解温度:65℃;酶解pH值:8.0;酶解时间:3h。再以羟自由基清除率为指标，确定Flavourzyme复合风味蛋白酶的最佳水解条件为:加酶量:50000U/g;温度:55℃; pH值:5.5;时间4h。酶解产物的分子量集中于四个区间，分别是:大于11000Da部分、1010-600Da部分、600-300Da部分及300-190Da部分。
　　再次，根据分子量分布的特点，采用超滤和纳滤对胶原蛋白肽进行分级和脱盐，得到了具有较高抗氧化性能的级分CBOP-C。采用凝胶过滤色谱(GPC)法，测定其分子量主要分布在两个范围，分别是2000Da-500Da，占61.387％，400Da-195Da，占38.613％，全积重均分子量为841.16Da。研究发现，CBOP-C的具有良好的等电点溶解性、热稳定性及保油性，而吸水性、保水性、乳化性及起泡性较弱。
　　最后，在生物体外、体内分别对CBOP-C的抗氧化性能做了研究。体外实验结果显示，添加CBOP-C可明显降低猪油和茶籽油的POV值;对·OH、 DPPH·、O2-·三种自由基均有清除作用;对Fe3+具有较强的还原能力;对Fe2+具一定的螯合能力。体内评价采用D-半乳糖致衰小鼠模型，用CBOP-C分别以高低剂量灌喂，以VE作为阳性对照。
　　结果表明:CBOP-C能显著提高致衰小鼠体内血清、肝组织、脑组织中的SOD活力(P＜0.05)，明显提高致衰小鼠肝组织和脑组织中的GSH-Px、CAT活力(P＜0.05)，显著降低血清、肝组织、脑组织中的MDA含量(P＜0.05)。

目录

摘要

1 绪论

1．1 鸡骨的概述

1．2 胶原蛋白的概述

1．3 胶原蛋白肽的研究现状

1．3．1 胶原蛋白肽的生理功能

1．3．2 胶原蛋白肽的制备方法

1．3．3 胶原蛋白肽的分离提纯方法

1．4 抗氧化性的评价方法概述

1．4．1 肽的抗氧化机理

1．4．2 抗氧化性测定方法

1．5 本课题的研究内容和意义

2 鸡骨胶原蛋白肽的酶法制备

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 原料预处理

2．2．2 鸡骨成分测定

2．2．3 鸡骨浸酸处理

2．2．4 鸡骨浸灰处理

2．2．5 鸡骨明胶提取

2．2．6 鸡骨胶成分的测定

2．2．7 蛋白酶活力测定

2．2．8 水解度的测定

2．2．9 羟自由基(·OH)清除率测定

2．2．10 Alcalase碱性蛋白酶水解鸡骨胶实验

2．2．11 Alcalase酶和Flavourzyme酶复合水解鸡骨胶原蛋白实验

2．2．12 鸡骨粗多肽的分子量测定

2．3 实验结果与分析

2．3．1 预处理后鸡骨成分含量

2．3．2 鸡骨浸酸实验结果

2．3．3 鸡骨浸灰实验结果

2．3．4 鸡骨明胶提取结果

2．3．5 鸡骨胶成分的测定结果

2．3．6 蛋白酶活力测定结果

2．3．7 Alcalase碱性蛋白酶水解鸡骨胶实验结果

2．3．8 Alcalase酶和Flavourzyme酶复合水解鸡骨胶实验结果

2．3．9 鸡骨粗多肽的分子量测定结果

2．4 本章小结

3 鸡骨胶原蛋白肽的分级及其特征性质研究

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 膜法分级鸡骨胶原肽工艺流程

3．2．2 膜法分级鸡骨胶原肽工艺参数的确定

3．2．3 各级分羟自由基清除能力的测定

3．2．4 分级鸡骨胶原肽的特征性质研究

3．3 实验结果与分析

3．3．1 膜法分级鸡骨胶原肽工艺参数的确定

3．3．2 各级分羟自由基清除能力的测定结果

3．3．3 分级纯化鸡骨胶原肽的理化性能研究结果

3．4 本章小结

4 鸡骨胶原蛋白肽的体外抗氧化性研究

4．1 实验材料与仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 鸡骨胶原蛋白肽在油脂体系中的抗氧化活性测定

4．2．2 鸡骨胶原蛋白肽清除自由基能力的测定

4．2．3 鸡骨胶原蛋白肽还原铁离子能力的测定

4．2．4 鸡骨胶原蛋白肽螯合铁离子能力的测定

4．3 实验结果

4．3．1 鸡骨胶原蛋白肽在油脂体系中的抗氧化活性测定结果

4．3．2 鸡骨胶原蛋白肽清除自由基能力的测定结果

4．3．3 鸡骨胶原蛋白肽还原能力的测定结果

4．3．4 鸡骨胶原蛋白肽螯合亚铁离子能力的测定结果

4．4 本章小结

5 鸡骨胶原蛋白肽对D-半乳糖致衰小鼠抗氧化性的研究

5．1 实验材料与仪器

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验仪器

5．2 实验方法

5．2．1 动物分组及饲喂

5．2．2 取材及处理

5．2．3 蛋白质含量测定

5．2．4 超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

5．2．5 丙二醛(MDA)含量的测定

5．2．6 谷胱甘过氧化物酶(GSH-Px)活力的测定

5．2．7 过氧化氢酶(CAT)活力的测定

5．2．8 数据处理

5．3 实验结果与分析

5．3．1 实验前后小鼠体重的变化

5．3．2 超氧化物歧化酶(SOD)活力测定结果

5．3．3 丙二醛(MDA)含量的测定结果

5．3．4 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的测定结果

5．3．5 过氧化氢酶(CAT)活力的测定结果

5．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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