兔OCT4基因启动子驱动RFP表达载体的构建及验证

摘要

OCT4转录因子在维持和调控胚胎干细胞的多能性中发挥着重要的作用。OCT4基因启动子驱动标志蛋白的表达对胚胎干细胞多能性研究和iPS的建立有重要的意义。由于绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)在慢病毒转染过程中常用作转染标记，因此构建兔OCT4基因启动子驱动红色荧光蛋白（Red fluorescent protein，RFP）的表达，将有利于兔iPS制备的研究。本研究通过PCR方法克隆了兔的OCT4启动子（rOCT4），构建了rOCT4驱动RFP的表达载体rOCT4-RFP，经转染小鼠ES细胞验证正确后，将rOCT4-RFP转染兔成纤维细胞系获得兔rOCT4-RFP成纤维细胞。结果:经过酶切和测序验证，证明rOCT4-RFP构建成功，而且能够在小鼠ES细胞系E14中表达细胞红色荧光蛋白，而分化后的rOCT4-RFP转基因E14细胞不表达红色荧光蛋白。通过脂质体介导的基因转移、抗性筛选和PCR鉴定建立了rOCT4-RFP转基因成纤维细胞系。
　　OCT4启动子的甲基化与干细胞的多能性有关，为将来研究OCT4启动子的甲基化与细胞的状态变化，拟建立甲基化的研究平台。本研究已获得pEGFP-C1转基因兔，pEGFP-C1是由CMV启动子启动GFP的表达，受甲基化影响体外培养的GFP兔成纤维细胞不表达绿色荧光。本研究基于对pEGFP-C1的转基因兔后代的成纤维细胞基因组CMV启动子甲基化水平的检测来验证GFP荧光表达受甲基化影响。

目录

摘要

1 绪论

1．1 胚胎干细胞的研究

1．1．1 胚胎干细胞

1．1．2 ES细胞的研究进展

1．2 现代动物转基因技术的研究概况

1．2．1 转基因动物的研究技术手段及历程

1．2．2 转基因兔的应用及进展

1．3 OCT4多能性的研究概况

1．4 DNA甲基化的研究概况

1．5 本研究的课题设计

1．5．1 OCT4的全能性

1．5．2 建立DNA甲基化-CMV启动子甲基化技术平台

2 实验方法和步骤

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要材料与试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 培养液的配制

2．2 实验操作方法

2．2．1 PCR

2．2．2 琼脂糖核酸电泳

2．2．3 胶回收纯化DNA

2．2．4 酶切

2．2．5 连接

2．2．6 转化

2．2．7 重组子的抽提、筛选和鉴定

2．2．8 ES细胞转染、挑克隆、传代、复苏细胞、冻存细胞的方法

2．3 质粒的构建方法

2．3．1 引物的设计

2．3．2 CMVRFP-C1的设计和构建

2．3．3 rOct4-RFP质粒得设计和构建

2．4 表达载体的验证

2．4．1 细胞转染和筛选建系

2．4．2 诱导rOCT4-RFP转基因E14细胞体外分化

2．4．3 rOCT4-RFP转染雄性兔体细胞

2．4．4 转基因成纤维细胞PCR鉴定

2．5 DNA甲基化-CMV启动子甲基化实验方法

2．5．1 DNA甲基化检测——亚硫酸盐修饰后测序法

2．5．2 成纤维细胞的培养及DNA的提取

2．5．3 亚硫酸修饰方法步骤

2．5．4 修饰后DNA回收方法步骤

2．5．5 甲基化的检测步骤

3 实验结果

3．1 质粒构建及鉴定

3．1．1 CMV-RFP-C1质粒和rOct4-RFP质粒的构建

3．2 胚胎干细胞转染鉴定

3．3 诱导mCT4-RFP转基因E14细胞体外分化

3．4 rOCT4-RFP转染兔成纤维细胞及鉴定

3．5 甲基化检测结果

4 讨论

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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