一种非cry基因启动子指导的Cry蛋白表达载体、构建方法及其应用

摘要

本发明涉及“一种非cry基因启动子指导的Cry蛋白表达载体、构建方法及其应用”，属于生物技术领域。本发明构建了一个高转录活性的非cry基因启动子PexsY，其序列如SEQ IDNO9所示。同时构建了含有启动子PexsY和cry基因的表达载体pHT315-PexsY-1Ac，实验表明，该非cry基因启动子PexsY能指导Cry蛋白的表达，扩展了启动子PexsY的使用范围，同时为Cry蛋白的表达，找到了新的启动子。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及非cry基因启动子指导的Cry蛋白表达载体构建方法及其应用。 

背景技术

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种革兰氏阳性产芽孢菌，广泛分布于自然界中，Bt属于蜡样芽胞杆菌族(B.cereus group，Bc)，与其它Bc族细菌相比，Bt最大的特点是在芽胞期母细胞中形成主要由Cry蛋白和Cyt蛋白组成的伴胞晶体（Aronson AI,Shai Y.Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective:unique features of their mode of action.FEMS Microbiology Letters,2001,195(1):1-8.）。由于Cry蛋白对多种重要农业害虫有特异的杀虫活性，且具有对人畜无害、不污染环境、无残留、生产原料及杀虫成分为天然产物、能保持生态平衡等优点，已成为世界上应用最广泛的微生物杀虫剂（Raymond B,Johnston PR,Nielsen-LeRoux C,Lereclus D,Crickmore N.Bacillus thuringiensis:an impotent pathogen?Trends in microbiology,2010,18(5):189-194.）。 

目前全世界已发现725种Cry蛋白（截止到2013年12月），根据蛋白的氨基酸序列同源性被分为72大类。Bt产生的由Cry蛋白组成的伴胞晶体可达细胞干重的20%以上，这主要是由于cry基因强启动子确保了mRNA持续且大量的生成，并且mRNA的稳定性在cry基因大量表达方面至关重要（邵宗泽,喻子牛.苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白超量表达的机制.生命科学,2000,8(12):173-176.）。根据其调控机制的不同，分为以cry1Ac基因为代表的芽胞依赖型cry基因和以cry3A基因为代表的非芽胞依赖型cry基因（Agaisse H,Lereclus D.How does Bacillus thuringiensis produce so much insecticidal crystal protein?Journal of bacteriology,1995,177(21):6027.Mahadeva Swamy H,Asokan R,Thimmegowda GG,Mahmood R.Expression of cry3A gene and its toxicity against Asian Gray Weevil Myllocerus undecimpustulatus undatus Marshall(Coleoptera:Curculionidae).Journal of basic microbiology,2013.）。 

苏云金芽胞杆菌因其是优良的生物农药，一直被广泛关注。寻找强启动子表达Cry蛋白，已经成为一种提高晶体蛋白产量的途径。已有报道表明，利用cry8E启动子表达cry1Ac基因，通过构建Bt高效表达载体pHT315-8E21b提高了Cry1Ac蛋白的产量（李朝睿,杜立新,彭琦,梁影屏,高继国,张杰,宋福平.苏云金芽胞杆菌高效表达载体的构建.微生物学通报,2013,40(2):350-361.）。但是，Cry蛋白的启动子类型有限，可选择构建高效表达载体的高活性的cry 基因启动子更是极少。因此，若利用高活性的非cry基因启动子指导Cry蛋白的表达，对提高具有高效杀虫活性、持效期长的Bt制剂有非常广阔的应用前景。 

发明内容

本发明的目的之一是选取编码芽胞外壁基质结构蛋白的exsY基因，比较其长短不同的两段启动子活性的强弱，筛选出一个强启动子，指导cry基因的表达。 

目的之二是应用筛选出的高活性的exsY基因启动子，构建一个指导Cry1Ac蛋白表达的载体，对其效率进行评估，以用于研制更为高效广谱的苏云金芽胞杆菌工程菌。 

一种表达载体，其结构特征为：将exsY基因启动子PexsY与cry基因融合，重叠片段插入经酶切后的骨架载体pHT315的多克隆位点之间，所述启动子PexsY的序列如SEQ ID NO9所示。 

所述表达载体为pHT315-PexsY-1Ac，所述cry基因为cry1Ac基因，其序列如SEQ IDNO1所示。 

表达载体pHT315-PexsY-1Ac的构建方法，包括如下步骤： 

(1)获得exsY高活性的启动子和cry1Ac基因融合的重叠片段PexsY-1Ac， 

(2)插入经酶切后的骨架载体pHT315的多克隆位点之间。 

所述步骤（1）的方法为：以Bt HD73菌株基因组DNA为模板，用引物对PexsY-F/PexsY-R扩增exsY基因ATG上游410bp和下游165bp的片段，大小为578bp；以Bt HD73菌株基因组DNA为模板，用引物对1Ac-F/1Ac-R（SEQ ID NO7/8）扩增cry1Ac基因及其SD序列GGAGG，大小为3562bp；回收两个PCR产物，以此为模板，用引物PexsY-F和1Ac-R进行重叠PCR，获得重叠片段PexsY-1Ac，大小为4140bp。 

所述骨架载体pHT315经Sal I/SphI双酶切。 

一种工程菌HD-PexsY1Ac-315菌株，其特征是含有上述表达载体。 

exsY基因启动子PexsY在指导Cry蛋白表达中的应用。 

所述应用为将含有启动子PexsY和cry基因的表达载体转入宿主菌株中进行表达。 

所述表达载体如上所述。 

本发明的技术方案如下： 

构建两段长度不同的exsY基因的启动子（PexsY-575和PexsY-410）与报告基因lacZ融合表达载体，并导入Bt HD73野生菌株中，通过β-半乳糖苷酶活性测定，比较两个启动子的活性，筛选出具有高转录活性的启动子PexsY-575，简称为PexsY，其序列如SEQ ID NO9所示。 

将强启动子PexsY-575与cry1Ac基因融合，得到的重叠片段连接到基础穿梭载体pHT315 中，获得非cry基因启动子指导的Cry蛋白表达载体pHT315-PexsY-1Ac，并将其导入Bt无晶体突变株HD73^-中，对该工程菌HD-PexsY1Ac-315进行蛋白定量，杀虫活性等效率评估。 

晶体形态观察：将HD-PexsY1Ac-315菌株接种于SSM培养基，至细胞大部分裂解，用扫描电子显微镜观察晶体形态（图5）。检测非cry基因启动子指导的Cry1Ac表达载体pHT315-PexsY-1Ac可正确表达Cry蛋白。 

蛋白产量测定：以无晶体突变株HD73^-为负对照，以HD-P3A1Ac-315菌株（由P3A启动子指导cry1Ac基因表达的菌株）和HD-P8E1Ac-315菌株（由P8E启动子指导cry1Ac基因表达的菌株）为正对照，利用SSM培养基培养HD-PexsY1Ac-315菌株至细胞完全裂解，采用660nm protein Assay Kit分别对四种菌株上样混合液中的总蛋白进行定量。调整上样量使总蛋白含量一致进行点样，利用SDS-PAGE检测各菌株杀虫晶体蛋白的产量（图6）。SDS-PAGE方法参见分子克隆实验指南[J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南（第二版）(金冬雁等).北京:科学出版社,1992]。 

杀虫活性测定：将HD-PexsY1Ac-315菌株1%接种于SSM培养基中，培养至细胞完全裂解，总蛋白定量后，根据不同的蛋白浓度梯度稀释与饲料混匀，测定对玉米螟（Ostriniafurnacalis）的活性。结果表明（表1），HD-PexsY1Ac-315对亚洲玉米螟具有很高的杀虫活性，LC₅₀为1.76μg/mL；HD-P3A1Ac-315的LC₅₀为1.40μg/mL与HD-PexsY1Ac-315相似；HD73和HD-P8E1Ac-315的LC₅₀分别为0.81μg/mL和0.66μg/mL，LC₅₀约为HD-PexsY1Ac-315的1/2，说明HD73和HD-P8E1Ac-315的杀虫活性高于HD-PexsY1Ac-315；HD73^-无晶体突变株对亚洲玉米螟无杀虫活性。以上结果表明非cry基因启动子指导表达的Cry蛋白具有杀虫活性，该启动子可以用来构建表达Cry蛋白的工程菌。 

附图说明

图1：exsY基因组组织和其启动子结构， 

图2：不同长度的PexsY启动子转录活性比较， 

图3：pHT315-PexsY-1Ac的物理图谱及表达区序列， 

图4：重组质粒pHT315-PexsY-1Ac酶切和PCR鉴定， 

1：DL15000Marker，2：pHT315-PexsY-1Ac/SalI单酶切产物，3：pHT315-PexsY-1Ac/Sal I+SphI双酶切产物，4：PCR鉴定产物， 

图5：Bt菌株透射电镜观察， 

A:HD73-;B:HD-PexsY1Ac-315;C:HD-P3A1Ac-315;D:HD-P8E1Ac-315， 

图6：Bt菌株Cry1Ac蛋白的SDS-PAGE分析。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。 

下面所用载体和菌株本申请人的实验室均有保藏，可以对外公开发放。 

所有培养基均为常规培养基。 

以下详述本发明的方案过程： 

1.大肠杆菌JM110热击感受态的制备 

为了获得含有外源基因的大肠杆菌转化子，制备大肠杆菌的热击转化感受态细胞[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.1989.Molecular cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbour Lab.,Cold SpringHarbour,NY)]。采用热击转化的方法转化大肠杆菌受体态细胞，以获得更多的含有外源基因的转化子。 

2.Bt电击感受态的制备 

为了提高Bt的转化效率，制备Bt的电击转化感受态细胞[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.1989.Molecular cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbour Lab.,Cold Spring Harbour,NY)]，采用电击转化的方法转化Bt受体菌细胞，以获得更多的含有外源基因的转化子。 

3.不同长度的PexsY启动子与lacZ融合的表达载体 

以Bt HD73菌株总DNA为模板，用相应的特异性引物进行PCR扩增，得到长短不同的启动子片段：PexsY-575和PexsY-410（图1），用限制性内切酶消化后与pHT304-18Z载体连接，得到的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定，验证质粒的正确性。将正确的重组质粒导入Bt HD73菌株中，获得菌株HD(PexsY-575)和HD(PexsY-410)。 

4.两种启动子转录活性比较 

将分别含有两种启动子的HD(PexsY-575)和HD(PexsY-410)菌株接种于SSM培养基[Schaeffer,P.,J.Millet,and J.P.Aubert,1965.Catabolic repression of bacterial sporulation.ProcNatlAcadSciU S A.54(3):p.704-11]，按固定的时间间隔取样，测定样品的β-半乳糖苷酶活性，比较两种启动子的活性，筛选出具有高转录活性的启动子（图2）。 

5.非cry基因启动子指导的Cry蛋白表达载体的构建 

将筛选到的强启动子PexsY-575与cry1Ac基因融合，得到的重叠片段连接到基础穿梭载体pHT315中，获得非cry基因启动子指导的Cry蛋白表达载体pHT315-PexsY-1Ac（图3），经酶切及测序验证重组质粒的正确性（图4）。 

6.非cry基因启动子指导的Cry1Ac工程菌的构建及其效率评估 

将重组质粒pHT315-PexsY-1Ac导入Bt无晶体突变株HD73^-中，获得工程菌株HD-PexsY1Ac-315。 

晶体形态观察：将HD-PexsY1Ac-315菌株接种于SSM培养基，至细胞大部分裂解，用扫描电子显微镜观察晶体形态（图5）。检测非cry基因启动子指导的Cry1Ac表达载体pHT315-PexsY-1Ac可正确表达Cry蛋白。 

蛋白产量测定：以无晶体突变株HD73^-为负对照，以HD-P3A1Ac-315菌株（由P3A启动子指导cry1Ac基因表达的菌株）和HD-P8E1Ac-315菌株（由P8E启动子指导cry1Ac基因表达的菌株）为正对照，利用SSM培养基培养HD-PexsY1Ac-315菌株至细胞完全裂解，采用660nm protein Assay Kit分别对四种菌株上样混合液中的总蛋白进行定量。调整上样量使总蛋白含量一致进行点样，利用SDS-PAGE检测各菌株杀虫晶体蛋白的产量（图6）。SDS-PAGE方法参见分子克隆实验指南[J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南（第二版）(金冬雁等).北京:科学出版社,1992]。由图6可知在总蛋白量一致的情况下，P8E启动子表达Cry1Ac量最高，比野生型HD73表达Cry1Ac量高；而PexsY启动子和P3A启动子表达的Cry1Ac产量接近，HD73^-无晶体突变株不表达Cry1Ac蛋白。说明HD-PexsY1Ac-315菌株能够表达130kD的Cry1Ac蛋白。 

杀虫活性测定：将HD-PexsY1Ac-315菌株1%接种于SSM培养基中，培养至细胞完全裂解，总蛋白定量后，根据不同的蛋白浓度梯度稀释与饲料混匀，测定对玉米螟（Ostriniafurnacalis）的活性。结果表明（表1），HD-PexsY1Ac-315对亚洲玉米螟具有很高的杀虫活性，LC₅₀为1.76μg/mL；HD-P3A1Ac-315的LC₅₀为1.40μg/mL与HD-PexsY1Ac-315相似；HD73和HD-P8E1Ac-315的LC₅₀分别为0.81μg/mL和0.66μg/mL，LC₅₀约为HD-PexsY1Ac-315的1/2，说明HD73和HD-P8E1Ac-315的杀虫活性高于HD-PexsY1Ac-315；HD73^-无晶体突变株对亚洲玉米螟无杀虫活性。以上结果表明非cry基因启动子指导表达的Cry蛋白具有杀虫活性，该启动子可以用来构建表达Cry蛋白的工程菌。 

实施例1 

1.1大肠杆菌JM110热击感受态的制备及转化 

挑取单菌落于5ml LB液体培养基，37℃震荡培养过夜；按1%接种量接种于100ml LB液体培养基中，37℃，220rpm培养2-2.5hr，（OD₆₀₀=0.5-0.6）；4℃，4000rpm离心10min；弃上清，向沉淀中加入50ml预冷的0.1M CaCl2悬浮细胞,置于冰上30min；4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；用2-4ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬细胞，分装成200μL/0.5mL离心管中，于4℃保存，一周内用完。将200μL感受态细胞与质粒混匀，冰浴30min，42℃热击1.5min， 

冰浴3min，加入800μL LB培养基，37℃培养60min，取200μL涂板，37℃培养。 

1.2Bt电击感受态的制备 

挑取单菌落于5ml LB液体培养基，30℃震荡培养过夜。按1%接种量接种于100ml BH液体 培养基中，37℃，220rpm培养3-4hr（OD600=3.0）。4℃，4000rpm离心10min。弃上清，加入预冷的超纯水悬浮细胞，4℃，4000rpm离心10min，重复两次，弃上清，向沉淀中加入1ml40%PEG重悬细胞，分装，-70℃保存备用。 

1.3不同长度的PexsY启动子与lacZ融合的表达载体 

以HD73菌株基因组DNA为模板，用引物对PexsY-410-F和PexsY-410-R（SEQ ID NO2/3），扩增exsY基因ATG上游410bp片段；用引物对PexsY-410-F和PexsY-575-R（SEQ ID NO2/4），扩增exsY基因ATG上游410bp、下游165bp的片段，总长度为575bp。以上两个片段，经限制性内切酶HindIII和PstI双酶切之后，插入质粒pHT304-18Z的相应位点，转化大肠杆菌JM110菌株，获得重组质粒pHTPexsY410和pHTPexsY575，图1为重组质粒构建示意图。重组质粒经PCR扩增、双酶切及测序鉴定，证明构建正确。将鉴定正确的质粒导入HD73野生菌株，分别获得含有不同启动子的菌株HD(PexsY-410)和HD(PexsY-575)。测序列，如SEQ ID NO9所示。1.4两种启动子转录活性比较 

将过夜活化的菌株HD(PexsY-575)和HD(PexsY-410)接入含有红霉素的SSM培养基[Schaeffer,P.,J.Millet,and J.P.Aubert,1965.Catabolic repression of bacterial sporulation.ProcNatlAcadSciU S A.54(3):p.704-11]中，30℃，220rpm振荡培养，从T₁₀（T₀为菌体对数生长期将要结束即将进入稳定期的时间点）取样至T₂₀（T₀后20小时），每2小时取样一次，每次取样2ml，12000×g离心弃上清，沉淀迅速置于-20℃保存。β-半乳糖苷酶活性测定：向沉淀中加入500μL Buffer Z（0.06M Na₂HPO₄·2H₂O，0.04M NaH₂PO₄·H₂O，0.01M KCl，0.001M MgSO₄·7H₂O）和0.2g钢珠,破碎细胞1min；4℃，12000×g离心5min，取20μl上清用于测定蛋白浓度，读取OD595值；取100μl上清与700μl Buffer Z混合，加入200μl ONPG（4mg/ml），混匀，37℃反应，计时直到反应液呈现黄色，加入500μl，1M Na₂CO₃，读取OD420值。根据公式计算Miller Units[Miller JH.1972.Experiments in Molecular Genetics.New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,352-355]。每组数据进行三次独立重复试验，取平均值。结果表明（图2），长度为410bp的PexsY启动子在芽胞晚期β-半乳糖苷酶活性较高，在T14达到峰值；长度为575bp、含有结构基因165bp的PexsY启动子在SSM培养基中芽胞晚期β-半乳糖苷酶活性非常高，在T16达到峰值，之后四个小时内保持高的转录活性。结果显示含有165bp结构基因的PexsY启动子转录活性远高于不含结构基因的PexsY启动子，这165bp序列中可能存在增强序列。因此，选取含有165bp结构基因的PexsY启动子进行指导Cry蛋白表达的载体构建。1.5非cry基因启动子指导的Cry蛋白表达载体的构建 

以HD73菌株基因组DNA为模板，用引物对PexsY-F和PexsY-R（SEQ ID NO5/6），扩增exsY基因ATG上游410bp和ATG下游165bp的片段，引物PexsY-F的5′端加入Sal I酶切位点，PexsY-R 的5′端加入TAA密码子，以终止exsY基因的翻译读码框，获得578bp的启动子片段；以HD73菌株基因组DNA为模板，用引物对1Ac-F和1Ac-R（SEQ ID NO7/8），扩增cry1Ac基因及其SD序列（RBS）GGAGG（为cry1Ac基因ATG上游6bp～11bp），在引物1Ac-R的5′端加入SphI酶切位点，获得3562bp的cry1Ac基因片段。分别回收上述两个PCR产物，以此为模板，用引物PexsY-F和1Ac-R进行重叠PCR，获得重叠片段PexsY-1Ac，大小为4140bp（图3）。经Sal I和SphI双酶切后，连接至pHT315载体的相应酶切位点，转化E.coli TG1，得到重组质粒pHT315-PexsY-1Ac并鉴定（图4）。该重组质粒的序列如SEQ ID NO1所示。 

1.6非cry基因启动子指导的Cry1Ac工程菌的构建及其效率评估 

重组质粒pHT315-PexsY-1Ac导入Bt无晶体突变株HD73^-中，得到HD-PexsY1Ac-315菌株。 

晶体形态观察：将HD-PexsY1Ac-315菌株和对照菌株HD73、HD-P3A1Ac-315、HD-P8E1Ac-315接种于SSM培养基，至细胞大部分裂解，离心，弃上清，将沉淀重悬于无菌水中，投射电子显微镜下观察晶体的形态。结果证明（图5），在HD73^-菌株中无晶体存在（图5A），而在HD-PexsY1Ac-315菌株中可观察到菱形晶体（图5B），与HD-P3A1Ac-315和HD-P8E1Ac-315中结果相似（图5C、D）。说明pHT315-PexsY-1Ac载体可以正确表达cry1Ac基因。 

蛋白产量测定：以无晶体突变株HD73^-为对照，利用SSM培养基培养HD-PexsY1Ac-315、HD-P3A1Ac-315和HD-P8E1Ac-315菌株至T₂₄。采用660nm proteinAssay Kit分别对菌株上样混合液中的总蛋白进行定量。调整上样量使总蛋白含量一致进行点样，利用SDS-PAGE检测各菌株杀虫晶体蛋白的产量（图6）。SDS-PAGE方法参见分子克隆实验指南[J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南（第二版）(金冬雁等).北京:科学出版社,1992]。由图6可知在总蛋白量一致的情况下，P8E启动子表达Cry1Ac量最高，比野生型HD73表达Cry1Ac量高；而PexsY启动子和P3A启动子表达的Cry1Ac产量接近，HD73^-无晶体突变株不表达Cry1Ac蛋白（图6）。说明HD-PexsY1Ac-315菌株能够表达130kD的Cry1Ac蛋白。 

杀虫活性测定：利用SSM培养基培养HD-PexsY1Ac-315菌株至细胞完全裂解，以野生型HD73、菌株HD-P3A1Ac-315和HD-P8E1Ac-315为阳性对照，以HD73^-无晶体突变株为阴性对照，将菌株制成粉剂，对粉剂中蛋白进行定量，然后稀释成不同的浓度，分别混入饲料拌匀，测定对玉米螟（Ostriniafurnacalis）初孵幼虫的活性。结果表明（表1），HD-PexsY1Ac-315对亚洲玉米螟具有很高的杀虫活性，LC₅₀为1.76μg/mL；HD-P3A1Ac-315的LC₅₀为1.40μg/mL与HD-PexsY1Ac-315相似；HD73和HD-P8E1Ac-315的LC₅₀分别为0.81μg/mL和0.66μg/mL，LC₅₀约为HD-PexsY1Ac-315的1/2，说明HD73和HD-P8E1Ac-315的杀虫活性高于 HD-PexsY1Ac-315；HD73^-无晶体突变株对亚洲玉米螟无杀虫活性。以上结果表明非cry基因启动子指导表达的Cry蛋白具有杀虫活性，该启动子可以用来构建表达Cry蛋白的工程菌。 

表1Bt菌株对亚洲玉米螟的杀虫活性 

注：NA表示无杀虫活性 。