番茄蓝光受体CRY1和CRY2基因沉默和过量表达植物表达载体的构建及转基因番茄研究

摘要

对于隐花色素的研究，在植物中主要是集中在对拟南芥的研究上，番茄隐花色素的研究目前有两篇报道，一篇是对CRYl的CCT进行反义操作后发现在蓝光下转基因植株表现出了长胚轴，在红光下却没有这样的表型。花青素减少，而叶绿素和二级向光性曲率却没有发生变化。另一篇则是对CRY2的过量表达，无论是在弱蓝光还是强蓝光下其节间都变短了，并且其叶子花青素和叶绿素含量同果实中的类黄酮和番茄红素含量都增加了。并且花期推迟，叶腋的分枝变得发达。本研究主要是通过构建番茄蓝光受体CRY1和CRY2基因基因沉默和过量表达植物表达载体，并以根癌农杆菌介导法转化番茄，以得到转基因植株。为进一步研究番茄隐花色素的功能，特别是对与番茄红素调控有关的基因功能进一步研究奠定基础。 本研究共分两部分：(1)番茄蓝光受体CRY1和CRY2基因基因沉默和过量表达植物表达载体的构建。通过基因重组技术构建了pBI121fsp—CRY1RNAi，pHB—CRY1RNAi，pHB—CRY10X，DHB—CRY2RNAi，pBI121fsp—CRY20X共五个植物表达载体。此部分内容主要包括以下研究：①提取番茄总RNA，反转录获得有关cDNA；②设计引物，通过PCR扩增得到用于构建载体所需的带有特异限制性内切酶位点的基因片断；③对于RNAi表达载体，需要先构建到中间表达载体pSK上；④对于RNAi植物表达载体，通过BamH I和Sac I对连接在中间载体pSK上的重组子进行双酶切再连接到经同样双酶切的pHB和pBI121fsp植物双元载体质粒上。而对于过量表达载体则直接利用带酶切位点的引物对PCR产物直接用于植物表达载体连接。pHB质粒是受CaMV35s启动子驱动，pBI121fsp质粒则是受番茄中一个在果实中特异表达基因(Lefsm1)的启动子的驱动。⑤连接产物转化大肠杆菌，重组子被命名为pBI121fsp—CRY1RNAi，pHB—CRY1RNAi，pHB-CRY10x，pHB-CRY2RNAi，pBI121fsp-CRY20X。⑥通过冻融法将重组质粒转入根癌农杆菌EHA105中。经酶切鉴定及PCR扩增检测，结果显示重组植物表达载体pBI121fsp-CRY1RNAi，pHB-CRY1RNAi，pHB-CRY10X，pHB-CRY2RNAi，pBI121fsp-CRY20X已成功构建，基因分别正确插入到载体pHB中CaMV35s启动子与Nos3'转录终止子和pBI121果实特异启动子与Nos3'终止子之间的多克隆位点中。(2)根癌农杆菌介导法转化番茄的研究。以根癌农杆菌叶盘转化法将基因导入番茄。包括5项实验研究：①植物材料的准备。以10％次氯酸钠溶液消毒番茄种子，发芽后取6～8天龄子叶做预培养；②根癌农杆菌接种于含Rif(20mg/L)及Kin(100mg/L)的LB液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养过夜。③根癌农杆菌介导质粒pBI121fsp-CRY1RNAi，pHB-CRY1RNAi，pHB-CRY10X。pHB-CRY2RNAi，pBI121fsp-CRY20X转化番茄子叶，转化通过农杆菌与切成小块的番茄子叶共培养、分化选择培养(pBI121fsp植物表达载体在含卡那霉素50mg/L的培养基中，pHB植物表达载体在含Basta 2mg/L的培养基中)进行：④番茄转基因抗性芽的获得；⑤抗性植株的检测。提取转基因植株总DNA，用根据抗性基因设计的引物作PCR检测。经根癌农杆菌介导转化番茄获得的转基因植株经抗性检测表明已经获得了阳性的转基因植株。

目录

声明

前言

第一部分 番茄蓝光受体CRY1和CRY2基因沉默和过量表达植物表达载体的构建

1引言

2材料和方法

2.1材料与仪器

2.2方法

3结果与分析

3.1 pMD18-T-CRY1，pMD18-T-CRY2重组质粒的鉴定

3.2 P1、P2的制备

3.3 pMD18-T-P1，pMD18-T-P2重组质粒的鉴定

3.4 pSK-P1，pSK-P2重组子鉴定

3.5鉴定pSK-P12，pSK-P22质粒重组子

3.6菌落PCR鉴定重组质粒pHB-P1-P12，pBI121fsp-P1-P12，pHB-P2-P22

3.7 pHB-CRY10X，pBI121fsp-CRY20X重组子菌落PCR的鉴定

小结

参考文献

第二部分CRY1和CRY2基因沉默及过量表达表达载体转基因番茄研究

1引言

2材料和方法

3方法

3.1构建的植物表达载体转化番茄

3.2转基因番茄的植物总DNA的提取

4结果与分析

4.1诱导培养时期的组织培养

4.2生根时期的组织培养

4.3移入土中的植株

4.4转基因植株的抗性基因PCR检测

4.5转基因植株表型及RT-PCR分析

5讨论

5.1植物组织培养技术原理

5.2关于外源基因导入植物的方法

5.3浸染农杆菌的浓度

5.4植物细胞的感受态状况

小结

参考文献

文献综述 植物隐花色素的研究进展

附录

完成和发表论文情况

致谢