真核荧光表达载体pEGFP-C3-SOX1的构建及瞬时表达

摘要

背景与目的 近年来，干细胞移植治疗中枢神经系统损伤及变性疾病日益受到医学界的重视。用于移植的干细胞主要包括胚胎干细胞、神经干细胞和间充质干细胞，其中间充质干细胞(MescnchwmlStemCells，MSCs)具有取材方便，易于体外培养扩增、不涉及伦理道德及不具有免疫排斥反应等优点，因而被认为是干细胞移植较为理想的种子细胞。 骨髓来源的间充质干细胞具有多向分化潜能，在实验条件下可以向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞及心肌细胞分化。近来研究表明，用多种方法还可在体内外诱导MSCs分化为神经样细胞。然而，应用传统方法诱导MSCs向神经细胞分化存在分化率低及不稳定等缺点，制约了其临床应用。寻找一种高效、稳定的神经诱导方法将会极大促进MSCs在神经移植领域的应用。而探索MSCs定向神经分化的分子调控机制，找到神经分化的关键基因或因子则是解决这一难题的突破口。 研究发现，SOXl(SRY-relatedHMG-b0xgenel)在胚胎神经发育的较早时期表达并发挥了重要作用，被认为与神经命运的决定和分化有关。过表达SOXl基因可促进多种胚胎干细胞和神经干细胞向神经方向分化，而SOXl对于骨髓间充质干细胞的神经分化有无影响，国内外并没有进行相关研究。因此，本实验构建携带增强型荧光蛋白的真核表达载体pEGFP．C3．SOXl并转染Eca-9706细胞，观察pEGFP-C3．SOxl转染效果及细胞瞬时表达情况，为进一步研究SOXl在骨髓间充质干细胞神经分化中的作用奠定基础。 实验方法 L采用RT-PCR的方法从小鼠早期胚胎中扩增出带有ECORl和HindIII双酶切位点的SOXl目的基因片断，用T-A克隆技术将SOXlcDNA克隆入pGEM．T载体，酶切法和测序鉴定扩增片断。 2．用E∞RI和HindⅢ双酶切获得目的片断，再与E∞RI和HindIII双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接，重组子转化JMl∞感受态大肠杆菌，酶切方法鉴定阳性菌落。 3．利用脂质体转染法将pEGFP-C3．SOxl转染Eca-9706细胞，继续培养12h、24h、48h、72h、96h及1w时荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。 结果 1.SOXl基因克隆采用RT-PCR的方法从小鼠早期胚胎中成功克隆出含有完整开放阅读框的鼠SOxlcDNA，总长度n76bp，与克隆载体pGEM-T连接，完成SOXl基因克隆，经蓝白筛选、酶切及测序鉴定重组体，获得阳性克隆。序列分析结果表明，SOXl基因序列与GcnBank所收录SOxl序列完全相同。 2.pEG即．C3．SOxl构建及酶切鉴定用E∞RI和HindIII双酶切pGEM．T-SOXl，将SOXl基因定向克隆到真核表达载体pEGFP-C3中，双酶切证实SOXl已成功克隆入pEGFP．C3中。 3.基因转染pEG即．C3．SOXl转染Eca-9706细胞并培养12h时，荧光显微镜可观察到绿色荧光蛋白GFP的少量表达，随着时间的延长，GFP的表达量增加，至72h时最强，平均转染效率可达76％。随后荧光逐渐减弱减少。未经转染的细胞未见发出绿色荧光。 结论 1小鼠早期胚胎表达SOXl，可用RT-PCR方法克隆该基因。 2完成了SOXl克隆载体的构建； 3完成了SOXl基因真核表达载体构建； 4真核表达载体pEGFP．C3．SOXl可转染Eca．9706细胞并在细胞中表达。

目录

文摘

英文文摘

郑重声明

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述一 骨髓间充质干细胞的神经分化研究进展

综述二 神经干细胞增殖和分化的多重调控机制

缩略词表

致谢