饮料作物及发酵饲料中自然附着乳酸菌群的分类学研究

摘要

本研究主要从不同地域、不同种类的玉米秸秆和青贮饲料材料入手，研究了这些材料中微生物菌群组成，对其中的乳酸菌进行了生理生化性质研究和16SrDNA序列测定，构建系统进化树；并对分离出的两株不同于已知属的乳酸菌进行了鉴定命名，对两个已知的乳酸杆菌属进行了重新鉴定。
　　 通过研究发现，从中国河南省的玉米秸秆中分离出的乳酸菌菌株的16SrDNA序列，显示这些菌株与基因库(GenBank)中的标准菌株具有高度的相似性(从99.4到100％)。优势乳酸菌群中的乳杆菌属(Lactobacillus)，包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。其他的乳酸菌种包括乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)，食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)和蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)，也存在于玉米秸秆中。本研究第一次较为全面地研究了与玉米秸秆上附着的乳酸菌，这些菌种也都是青贮发酵中的重要菌种。鉴定结果揭示了玉米秸秆中的乳酸菌构成，为进一步筛选适当的青贮发酵微生物菌剂，从而提高青贮发酵品质提供可能。
　　 从北京近郊的几个奶牛场中的青贮玉米，青贮饲料稻、青贮高粱和青贮苜蓿中分离出乳酸菌，根据形态学和生理生化特性、γ-氨基丁酸(GABA)产生能力、16S rRNA基因序列等特征，这些菌株被分为8个组(A-H)，他们分别被鉴定为Weissella cibaria，融合魏斯氏菌(Weissella confusa)，柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)，Leuconostoc lactis，类肠膜明串珠球菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)，乳酸乳球菌乳球菌亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)，类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。青贮玉米、青贮高粱和青贮饲料稻都保存完好，而青贮苜蓿的品质则相对较差。本实验证实了青贮饲料中栖息着丰富的乳酸菌，表明了不同的乳酸菌自然群体可能会影响青贮的发酵品质。这些结果将促使对乳酸菌种和青贮发酵品质之间的关系的进一步研究，并将促进合适的青贮乳酸菌剂的筛选开发。
　　 经过分类学方法对两株从青贮苏丹草中分离的乳酸菌进行的鉴定，它们分别是革兰氏阳性、过氧化氢酶反应阴性、兼性厌氧的杆菌且不能发酵葡萄糖产气。这两株菌展现出的种内DNA-DNA相关性高于93.5％，并且具有相同的表型特性，表明它们组成了一个单独的种。这两株菌DNA的G+C含量是58.5-59.2 mol％，基于16S rDNA序列分析，它们被归类于Lactobacillus属，在分子进化树上，和Lactobacillus manihotivorans JCM12514T和山茶花乳杆菌(Lactobacilluscamelliae)JCM13995T最接近，SU18T和这两个标准菌株的序列相似性分别高达95.9和96.8％，而核糖体分型模式表明SU18T能够很清晰地同相关的乳酸杆菌属的其他种分开，DNA-DNA杂交结果显示SU18T和两个标准菌株Lactobacillusmanihotivorans和Lactobacillus camelliae的DNA-DNA相关性很低(<23.7％)，表明它们分属于不同的种。由此推知，这两株归类于Lactobacillus属的菌是新种，命名为那须乳杆菌(Lactobacillus nasuensis sp.Nov.)，标准菌株是SU18T(=JCM17158T=CGMCC No.1.10181)。
　　 菌株CW1与模式菌株泡菜乳杆菌(Lactobacillus kimchii)和类植物乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)的16S rRNA基因序列相似性都高于99.6％，与二者之间的DNA-DNA关联性大于87％。为了澄清Lactobacillus kimchii和Lactobacillusparalimentarius的分类学位置，分别进行了形态学特性，16S rRNA基因序列，核糖体分型和DNA-DNA相关性实验。两个模式菌株表现出一些碳源发酵形式上的差异：L-阿拉伯糖(L-arabinose)，D-木糖(D-xylose)，松三糖(melezitose)和葡萄酸盐(gluconate)。分子实验结果表明，Lactobacillus paralimentarius是与Lactobacilluskimchii距离最近的种，它们的16S rRNA基因序列相似性达99.9％，并且，这个结果也被Lactobacillus paralimentarius JCM10415T和Lactobacillus kimchii JCM10707T间极高的DNA-DNA相关性(relatedness value)(≥82％)所证实。因此，可以推定Lactobacillus kimchii和Lactobacillus paralimentarius为同物异名。