PTX对GPER介导的雌激素激活的子宫内膜癌细胞中PI3K/AKT信号通路的影响

摘要

背景与目的:
　　 子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升。但子宫内膜癌的临床治愈率改善不明显，尤其是晚期和复发患者的中位生存时间仍不足1年。子宫内膜在缺乏孕激素对抗的高雌激素水平的长期刺激下，可以发生异常增生并向恶性转化，从而导致子宫内膜癌的发生，但目前雌激素导致子宫内膜癌的发病机制尚不完全明了。传统观点认为，雌激素与其受体结合后在细胞核内通过“转录效应”发挥作用。然而，该作用模式并未能使子宫内膜癌和乳腺癌等激素依赖性肿瘤得到有效的控制;除了经典的“转录效应”，雌激素还可以通过“非转录效应”发挥作用。研究表明，雌激素还可以激活子宫内膜癌细胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路，发挥“非转录效应”促进癌细胞生长。那么，什么介导了雌激素的“非转录效应”？最可能的候选分子是G蛋白偶联雌激素受体(GPER)。本课题组的前期研究表明，GPER在雌激素受体(ER)高表达的子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞（ERα、ERβ均阳性表达）和ER低表达的子宫内膜癌细胞系HEC-1A细胞（ERα阳性表达，ERβ阴性表达）中均有不同程度的表达，本研究通过应用GPER阻断剂——百日咳毒素(PTX)阻断GPER的作用后，观察其对Ishikawa和HEC-1A细胞中雌激素激活的Akt活化状态的影响，以及细胞中GPER和ERα、ERβ蛋白表达的变化，以了解PTX对GPER介导的雌激素活化的子宫内膜癌细胞中PI3K/AKT信号通路的影响。
　　 材料与方法:
　　 1.材料
　　 子宫内膜癌细胞系Ishikawa及HEC-1A均由北京大学人民医院妇产科重点实验室魏丽惠教授惠赠。
　　 2.方法
　　 采用静置贴壁体外培养法培养人子宫内膜癌HEC-1A及Ishikawa细胞;当HEC-1A及Ishikawa细胞进入对数生长期后，采用免疫组化SP法分别检测两种细胞系中GPER蛋白的表达;将不同浓度(0、0.1、0.5、1.0μg/ml)的PTX分别处理HEC-1A及Ishikawa细胞30min后;再予上述浓度的PTX分别联合17β雌二醇(17β-E2;1×10-6mol/L)共同处理HEC-1A细胞15min、Ishikawa细胞30min，采用蛋白印记法检测HEC-1A及Ishikawa细胞中GPER，ERα、ERβ蛋白的表达及AKT的活化状态[AKT的活化状态以磷酸化AKT(p-Akt)/Akt表示]。
　　 3.统计学分析
　　 对实验结果采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。结果以（x）+s表示，经过正态性和方差齐性检验后行方差分析，各组间的两两比较用Bonferroni法，P＜0.05为显著性检验标准，实验结果均重复3次。
　　 结果:
　　 1.免疫组化法检测显示，在Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER蛋白均在细胞质中呈棕黄色阳性表达。
　　 2.蛋白印迹法检测显示:不同浓度(0、0.1、0.5、1.0μg/ml)的PTX联合17β-E2（1×10-6mol/L）处理后:
　　 (1)在Ishikawa细胞中，p-Akt/Akt分别为0.74±0.54、0.34±0.06、0.18±0.03、0.07±0.15，GPER蛋白的表达水平分别为0.872±0.490、0.395±0.054、0.145±0.014、0.034±0.008，随着PTX浓度的增加，p-Akt/Akt、GPER蛋白的表达水平均明显下降(P＜0.05)，且当PTX浓度为1.0μg/ml时下降最显著（F=63.729，P=0.0001;F=160.284，P=0.0001）;而ERα和ERβ蛋白的表达水平均无明显变化（P＞0.05）。
　　 (2)在HEC-1A细胞中，p-Akt/Akt分别为0.73±0.09、0.26±0.14、0.11±0.03、0，GPER蛋白的表达水平分别为0.927±0.134、0.485±0.022、0.194±0.004、0，随着PTX浓度的增加，p-Akt/Akt、GPER蛋白的表达水平均明显下降（P＜0.05），且当PTX浓度为1.0μg/ml时均降至0（F=1039.321，P=0.0001;F=833.613，p=-0.0001）;而ERα蛋白的表达水平无明显变化(P＞0.05)，ERβ蛋白呈阴性表达。
　　 结论:
　　 在子宫内膜癌HEC-1A和Ishikawa细胞中，PTX阻断GPER后，可抑制雌激素对子宫内膜癌细胞PI3K/Akt信号通路的活化作用。提示我们:GPER参与了雌激素对子宫内膜癌细胞PI3K/Akt信号通路的活化。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

实验材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学方法

结果

1 Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER蛋白的表达

2 Ishikawa和HEC-1A细胞中Akt的活化状态

3 Ishikawa和HEC-1A细胞中GPER、ERα及ERβ蛋白的表达

讨论

1 GPER蛋白表达的意义

2 阻断GPER蛋白的表达与PI3K／Akt信号通路活化的关系

结论

参考文献

综述

个人简历及在学期间发表的学术论文

致谢