NEDD9在肺腺癌中的表达及其基因沉默对肺腺癌A549细胞生物学行为的影响

摘要

研究背景：
　　 肺腺癌是严重危害人类健康的最常见恶性肿瘤之一，其恶性程度高，容易发生复发和转移。因目前对肺腺癌的复发和转移治疗效果不理想，导致患者死亡率非常高。这迫使科研工作者和临床医师不断努力寻找肺腺癌侵袭转移相关的基因改变，阐明肺腺癌复发和转移的分子机制，从根本上攻克肺腺癌的复发和转移。
　　 神经元表达发育下调基因(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 9，NEDD9)是一个侵袭转移相关基因，属于CAS(Crk-associated substrate)家族的一员。与其它CAS家族成员一样，NEDD9在多种肿瘤转移时高表达。NEDD9表达量在不同类型的组织和细胞中，及在不同生长条件下有所不同。在正常的人体组织如肺和肾组织中，在含有丰富的未成熟淋巴细胞的组织和在胎儿的大脑中NEDD9mRNA和蛋白的表达水平高（虽然在成人大脑表达下调）。NEDD9在上皮细胞来源的肿瘤细胞株、淋巴瘤细胞株、恶性胶质瘤株和黑色素瘤细胞株中含量丰富。然而NEDD9在肺腺癌细胞中的表达未见研究，NEDD9表达与肺腺癌的临床病理特征需要进一步研究。
　　 研究目的：
　　 通过检测肺腺癌及邻近非癌组织中NEDD9的表达，初步分析NEDD9异常表达与肺腺癌临床病理参数的关系，评价肺腺癌组织中NEDD9异常表达的临床意义。进而采用RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术研究肺腺癌细胞中NEDD9基因沉默后对肺腺癌细胞生长、凋亡、迁移和侵袭的影响，探讨其异常表达与肺腺癌细胞生物学行为的关系，初步探讨NEDD9参与肺腺癌侵袭和转移的可能分子机制。然后，体内试验观察沉默NEDD9表达后对裸鼠移植瘤生长的影响。本研究分为以下四个部分:
　　 第一部分：NEDD9在肺腺癌中的表达及其意义
　　 方法：
　　 (1)收集郑州大学第一附属医院胸外科和河南省肿瘤医院手术切除的36例病人的新鲜肺腺癌组织及邻近非癌肺组织标本。
　　 (2)利用免疫组织化学方法检测肺腺癌和邻近非癌肺组织标本中NEDD9的表达和定位。同时应用免疫组化染色评分对比分析36例肺腺癌病人癌组织染色情况。提取新鲜肺腺癌组织和邻近非癌肺组织总RNA利用qRT-PCR(qRT-PCR)的方法检测肺癌标本中NEDD9mRNA的表达。分析NEDD9异常表达与肺腺癌临床病理参数的关系。
　　 (3)培养三种不同侵袭力的肺腺癌细胞，提取细胞总RNA利用qRT-PCR的方法检测各肺腺癌细胞系中NEDD9的表达情况。
　　 结果：
　　 (1)免疫组化结果显示NEDD9阳性染色定位于肺腺癌的细胞核和/或细胞质中，肺腺癌组织的平均染色评分显著高于邻近非癌组织(P＜0.01），在有转移的肺癌组织中NEDD9的表达量较无转移的肺癌组织高，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.01）。
　　 (2)qRT-PCR显示肺腺癌组织的NEDD9mRNA表达显著高于邻近非癌组织(P＜0.01)，NEDD9mRNA与淋巴结转移、TNM分期和分化程度均显著相关（P均＜0.05）。
　　 (3)利用qRT-PCR的方法检测了三种肺癌细胞系A549、95D及SPC-A-1中NEDD9的表达，结果显示NEDD9在三种肺腺癌细胞系中均高表达，高侵袭力肺腺癌细胞系A549中表达量最高。
　　 小结：
　　 NEDD9过表达提示其可能参与了肺腺癌发生发展及浸润转移过程。
　　 第二部分：NEDD9基因特异性shRNA真核荧光表达载体的构建和鉴定
　　 方法：
　　 (1)NEDD9的siRNA的特异性靶序列和无关对照序列的设计:依据GenBank中NEDD9的基因(NM182966)序列，使用Clontech公司的RNAiDesigner软件，设计出针对NEDD9的三个siRNA的特异性靶序列和无关对照序列。
　　 (2)以真核荧光表达载体pRNAT-CMV3.2为基础构建NEDD9基因特异性siRNA重组真核表达载体:将上述设计的序列在一定条件下退火，利用T4DNA连接酶将退火产物与质粒pRNAT-CMV3.2/neo连接，分别得到三个pRNAT-CMV3.2-NEDD9-siRNA和阴性pRNAT-CMV3.2-siNC重组质粒，DNA测序证实。
　　 (3)按说明利用构建的重组质粒转染肺腺癌A549细胞，通过qRT-PCR、Westernblot检测NEDD9在mRNA水平和蛋白水平的变化。筛选出一条抑制效率最高的NEDD9特异性siRNA进入下一步研究。
　　 结果：
　　 (1)成功构建了针对NEDD9的siRNA表达载体。
　　 (2)将所构建的NEDD9特异性siRNA重组质粒转染肺腺癌A549细胞，应用qRT-PCR和Westernblot检测分析NEDD9在基因和蛋白水平的表达，发现与三个对照组相比，干扰组NEDD9表达明显降低(P＜0.01)。
　　 (3)NEDD9基因(NM_182966)648-666位(GTGTCCTATTTCTTAGTGA)为靶序列，siRNA抑制作用最强。
　　 小结：
　　 成功构建了NEDD9特异性siRNA重组荧光表达载体，可明显抑制肺腺癌A549细胞中NEDD9的表达。
　　 第三部分：沉默NEDD9表达对肺腺癌A549细胞生物学行为的影响
　　 方法：
　　 (1)我们前期研究显示小干扰RNA可以下调肺腺癌A549细胞中的NEDD9表达，为了进一步研究NEDD9基因敲除后的分子机制，我们采用慢病毒包装siN648，并设立无关慢病毒对照序列，利用慢病毒介导的短发夹RNA(shorthairpinRNA，shRNA)建立NEDD9基因稳定沉默的肺腺癌细胞株。
　　 (2)qRT-PCR和Westernblot检测A549、A549-NC，A549-siRNA细胞中NEDD9在mRNA和蛋白水平的表达。Westernblot分析A549、A549-NC，A549-siRNA细胞中Bcl-2、Bax、TIMP1、MMP9和CylinE蛋白的表达。
　　 (3)通过软琼脂克隆形成实验检测沉默NEDD9基因后A549细胞增殖能力的变化。
　　 (4)利用流式细胞仪检测沉默NEDD9基因后A549细胞周期和凋亡的变化。
　　 (5)利用划痕实验及Transwell侵袭实验检测沉默NEDD9基因后A549细胞体外迁移能力和侵袭能力的变化。
　　 结果：
　　 (1)慢病毒成功感染并得到稳定感染的细胞株。与A549和A549-NC组相比，A549-siRNA细胞中NEDD9表达明显降低。
　　 (2)与A549和A549-NC组相比，A549-siRNA细胞中MMP9、Bcl-2和CyclinE蛋白明显降低，而TIMP1和Bax蛋白表达增加。
　　 (3)与A549和A549-NC组相比，A549-siRNA组细胞的增殖显著受抑制，A549-siRNA组的单细胞克隆集落形成数显著降低(F=11.517，P=0.009)。
　　 (4)与A549和A549-NC组相比，A549-siRNA组细胞的S期细胞明显减少(P＜0.01)，A549-siRNA组细胞凋亡明显增加（F=1433.276，P=0.000）。
　　 (5)与A549和A549-NC组相比，无血清培养48h后，A549-siRNA组细胞的划痕距离明显增宽;与A549、A549-NC组相比，聚碳酸酯膜下室面的A549-siRNA组细胞数明显减少(F=280.153，P=0.000)。
　　 小结：
　　 (1)体外siRNA沉默A549细胞NEDD9表达，可显著抑制肺腺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力，促进细胞凋亡。
　　 (2)NEDD9可能通过促进MMP9和CyclinE表达，降低TIMP1表达，抑制凋亡参与肺腺癌的侵袭和转移。
　　 第四部分：沉默NEDD9基因对裸鼠移植瘤生长的影响
　　 方法：
　　 (1)18只雌性裸鼠随机分成空白组、阴性对照组和NEDD9-siRNA组，每组6只。采用细胞悬液皮下接种5×106/0.1ml的方法制作裸鼠移植瘤模型。于注射5W后处死裸鼠，按公式计算肿瘤瘤重及肿瘤体积并绘制生长曲线。
　　 (2)HE染色观察移植瘤细胞形态，并应用免疫组化方法检测NEDD9在蛋白质水平的表达情况，TUNEL方法检测凋亡情况。
　　 结果：
　　 (1)注射5W后A549-siRNA组裸鼠肿瘤的肿瘤重量(0.13±0.06)g小于A549组(0.37±0.13)g和A549-NC组(0.35±0.10)g，组间差异有统计学意义(F=9.745，P=0.002)，而空白组和阴性对照组组间差异无统计学意义（P＞0.05）。A549-siRNA组移植瘤的体积明显小于其他两组(F=10.149，P=0.002)。
　　 (2)HE染色见对照组裸鼠肿瘤细胞核大，分裂像不规则，核仁清楚，肿瘤组织内可见纤维间隔;而A549-siRNA组所有的肿瘤组织中可以看到大量的肿瘤组织坏死，坏死的肿瘤细胞由纤维组织代替。
　　 (3)与A549和A549-NC组相比，A549-siRNA组移植瘤细胞凋亡显著增加（F=147.948，P=0.000）。
　　 (4)与A549和A549-NC组相比，A549-siRNA组移植瘤免疫组化染色评分显著降低（F=3.981,P=0.041）。
　　 小结：
　　 沉默NEDD9基因可抑制A549裸鼠移植瘤的生长、促进移植瘤细胞的凋亡。
　　 全文结论：
　　 (1)NEDD9基因表达异常与肺腺癌的发生发展关系密切，参与了肺腺癌细胞的恶性转化。
　　 (2)NEDD9通过促进MMP9和CyclinE表达，抑制凋亡参与肺腺癌的侵袭和转移。
　　 (3)沉默NEDD9基因可抑制A549裸鼠移植瘤的生长、促进移植瘤细胞的凋亡。
　　 (4)NEDD9有望成为肺腺癌基因治疗的候选靶点。

目录

声明

摘要

缩略词

引言

第一部分 NEDD9在肺腺癌中的表达及其意义

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

第二部分 NEDD9基因特异性shRNA真核荧光表达载体的构建和鉴定

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

第三部分 沉默NEDD9表达对肺腺癌A549细胞生物学行为的影响

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

第四部分 沉默NEDD9基因对裸鼠移植瘤生长的影响

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

全文结论

参考文献

综述

个人简历及攻读博士期间发表的论文

致谢