慢性鼻-鼻窦炎中细菌生物膜与溶菌酶，SLPI和gp340关系的实验研究

摘要

慢性鼻-鼻窦炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是耳鼻咽喉头颈外科的常见多发病，是鼻腔鼻窦黏膜的慢性炎性疾病，严重影响患者的生活质量。CRS的发病是多种致病因素交叉作用的结果，致病菌感染是其中重要因素之一。细菌生物膜是不同于游离菌的另一种细菌存在形式，由细胞外保护性基质和包裹其中的细菌群落组成，是具有一定空间构型的高度组织化的结构。生物膜形成后，细菌对宿主免疫及抗生素类药物的抵抗较游离菌大大增强。据估计，约65％的人类慢性细菌性感染与生物膜有关。细菌生物膜在CRS患者鼻腔鼻窦黏膜表面的检出率约为30-80%，可能是加重CRS病情的重要因素。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌是成人CRS的重要致病菌，目前认为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜形成与CRS重症化和难治化之间存在相关性。
　　固有免疫是机体抵御环境微生物的第一道防线。溶菌酶，分泌性白细胞蛋白酶抑制剂（secretory leukocyte proteinase inhibitor，SLPI）和糖蛋白340（glycoprotein340，gp340）是鼻腔黏膜固有免疫应答的重要蛋白，分别在识别，调控，杀菌等多个环节发挥作用。目前不同生物膜状态的CRS中溶菌酶，SLPI和gp340的表达情况未见报道；国内外关于溶菌酶，SLPI和gp340对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的效应研究较少。为此我们通过在临床收集 CRS患者鼻窦黏膜标本及在体外建立鼻窦黏膜离体组织模型和金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌生物膜模型，采用免疫组化，逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR），Western blot，荧光标记和激光共聚显微镜观察等手段，就细菌生物膜对鼻窦黏膜溶菌酶，SLPI和gp340表达的调控以及溶菌酶，SLPI和gp340对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的抑制进行实验研究；以初步阐明细菌生物膜与上述固有免疫相关分子之间的相互作用，为进一步研究CRS中细菌生物膜影响宿主固有免疫可能的机制奠定基础，也为探索CRS新的治疗途径提供思路。
　　本研究由以下三部分组成：
　　第一部分：溶菌酶，SLPI和gp340在细菌生物膜相关慢性鼻-鼻窦炎中的表达
　　目的：
　　探讨溶菌酶，SLPI和gp340在具有不同细菌生物膜状态的慢性鼻-鼻窦炎患者鼻窦黏膜的表达情况。
　　方法：
　　收集CRS患者63名和对照组脑脊液鼻漏患者20名的筛窦黏膜样本，以激光共聚显微镜观察鼻窦黏膜样本表面细菌生物膜情况，分别以RT-PCR，免疫组化和Western blot检测溶菌酶，SLPI和gp340在鼻窦黏膜中的表达。
　　结果：
　　35/63（55.6%）的 CRS患者细菌生物膜阳性，对照组未检出细菌生物膜。CRS患者溶菌酶，SLPI和gp340的mRNA和蛋白表达水平均较对照组上调；细菌生物膜阳性CRS患者溶菌酶，SLPI和gp340的mRNA和蛋白表达水平较细菌生物膜阴性的CRS患者增强。
　　结论：
　　溶菌酶，SLPI和gp340在鼻窦黏膜中呈组成性表达，CRS患者溶菌酶，SLPI和gp340在mRNA和蛋白水平的表达上调与细菌生物膜有关，CRS中细菌生物膜和固有免疫应答的改变密切相关。
　　第二部分：金黄色葡萄球菌生物膜对人离体鼻窦黏膜溶菌酶，SLPI和gp340表达的影响
　　目的：
　　探讨不同表型金黄色葡萄球菌对人离体鼻窦黏膜组织溶菌酶，SLPI和gp340表达的影响。
　　方法：
　　采集10例经鼻内镜脑脊液鼻漏修补术患者的筛窦黏膜进行离体组织培养并建立金黄色葡萄球菌游离菌和生物膜感染模型。以激光共聚显微镜确认模型建立成功，分别在建模后8小时，16小时及24小时以ELISA法测定溶菌酶，SLPI和gp340分泌水平；24小时后以RT-PCR，免疫组化和Western blot法检测培养组织中溶菌酶，SLPI和gp340的mRNA和蛋白表达水平。结果金黄色葡萄球菌游离菌和生物膜刺激溶菌酶，SLPI和gp340在离体鼻黏膜组织模型中表达上调的水平不同；模型中溶菌酶，SLPI和gp340的分泌水平呈现时间依赖趋势。
　　结论：
　　金黄色葡萄球菌生物膜较游离菌更能诱导溶菌酶，SLPI和gp340在鼻窦黏膜组织中高表达，是影响宿主固有免疫的重要因素。
　　第三部分：溶菌酶，SLPI和gp340对体外金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的作用
　　目的：
　　通过体外实验研究溶菌酶，SLPI和gp340对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的作用。
　　方法：
　　体外培养金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌参考株及临床分离株，不同方法建立细菌生物膜体外模型。分别在细菌生物膜形成的不同阶段用不同浓度的溶菌酶，SLPI和gp340进行干预；以结晶紫染色，Baclight染色，alamarBlue检测和激光共聚显微镜观察分析干预效果。
　　结果：
　　溶菌酶，SLPI和gp340在体外对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌游离菌和生物膜有不同程度的杀伤作用；两种蛋白联合的抗菌与抗生物膜效应较单一蛋白显著增强。结论生物膜形成是细菌抵抗机体免疫反应的重要机制；溶菌酶，SLPI和gp340是重要的抗菌蛋白，在固有免疫应答中互相配合发挥效应。

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缩略词对照表

第一部分：溶菌酶，SLPI和gp340在生物膜相关慢性鼻-鼻窦炎中的表达

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分：金黄色葡萄球菌生物膜对人离体鼻窦黏膜溶菌酶，SLPI和gp340表达的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分：溶菌酶, SLPI和gp340对体外金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

全文结论

综述:生物膜与慢性鼻-鼻窦炎

攻读博士学位期间发表论文

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