肝脏NK细胞对梗阻性黄疸小鼠模型急性肝损伤及肝纤维化的影响

摘要

前言：梗阻性黄疸（obstructive jaundice，OJ）是临床上常见病理状态，主要导致肝脏损伤，随着梗阻时间延长,肝脏最终发展为胆汁淤积性肝硬化。目前对梗阻性黄疸急性肝损伤及肝纤维化治疗措施有限，因此研究其肝损伤的发病机制对治疗有重要意义。自然杀伤（natural killer，NK）细胞在肝脏中含量丰富，是肝脏免疫的第一道防线。相比外周血液中的NK细胞，肝脏NK细胞除了固有免疫功能外还有特殊的功能，很多研究发现肝脏NK细胞在多种肝脏疾病中功能失调并参与肝脏疾病肝损伤。研究证实活化的NK细胞可通过直接杀伤肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）及通过产生细胞因子IFN-γ抑制肝纤维化。目前关于肝脏NK细胞在梗阻性黄疸肝损伤及肝纤维化中的作用研究较少。
　　目的：通过构建梗阻性黄疸小鼠模型，研究肝脏NK细胞对梗阻性黄疸小鼠模型急性肝损伤及肝纤维化的影响，并初步探讨其相关机制。
　　方法：小鼠随机分为4组，每组40只，A组：手术+Poly I:C组、B组：手术+PBS组、C组：假手术+Poly I:C组、D组：假手术+PBS组。手术组行胆总管双重结扎术（bile duct ligation，BDL）构建梗阻性黄疸模型，假手术组仅游离胆总管。A、C组腹腔注射聚肌胞（Poly I:C）诱导NK细胞肝内活化及聚集，B、D组注射等量磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照。于第7天及第14天两个时相取各组小鼠血液及肝脏标本，比较各组小鼠血清肝功能各指标、肝组织HE染色、Masson三染色、NF-κB免疫染色、α-SMA免疫染色及实时荧光定量聚合链反应检测肝脏NK细胞表面特异性标志NK1.1、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）、NF-κB、α-SMA及肿瘤坏死因子（TNF）-α mRNA表达量变化，观察梗阻性黄疸模型病理生理过程，对比各组急性肝损伤及肝纤维化的程度，探究肝脏NK细胞及与急性肝损伤及肝纤维化的关系。
　　结果；胆总管结扎术成功构建了小鼠梗阻性黄疸模型，术后第7天以急性肝损伤为主要表现，血清肝功能指标升高，肝质比升高，肝脏呈淤胆表现，肝脏出现大量片状坏死，Kuffer细胞活化产生大量TNF-α，NF-κB活化增多，NK1.1、TRAIL mRNA表达增多。第14天模型组小鼠肝脏肝损伤加重，并出现明显的肝硬化表现，同时，第14天肝脏NK1.1阳性细胞及TRAIL表达较第7天增多，与肝损伤呈正相关，推断NK细胞出现免疫紊乱，NK细胞可能参与梗阻性黄疸肝损伤。与PBS对照组比较，Poly I:C干预组肝脏NK细胞数量增多，表明Poly I:C成功诱导NK细胞肝内聚集；手术组A组和B组比较，第7天肝功能指标谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST） A组较B组升高，HE染色肝细胞坏死面积A组较B组增大，NF-κB及TNF-α表达增高，TRAIL表达增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；第14血清肝功能AST、ALT及TNF-α表达A组较B组高，HE染色、Masson染色结果表明A组较B组肝纤维化程度重，肝脏α-SMA表达A组较B组增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。假手术组C组和D组比较，第7天及第14天血清肝功能指标、HE染色、Masson三染色及NF-κB、TNF-α、α-SMA、TRAIL的表达均无统计学差异（P＞0.05）。
　　结论：⑴小鼠模型中，肝脏NK细胞含量增多，并与肝损伤严重程度相关，提示梗阻性黄疸伴随着肝脏NK细胞细胞免疫功能紊乱。⑵Poly I:C诱导肝脏NK细胞活化与聚集，加重梗阻性黄疸急性肝损伤，肝脏NK细胞可能通过TRAIL途径参与梗阻性黄疸急性肝损伤。⑶Poly I:C诱导的肝脏NK细胞活化与聚集，加重了梗阻性黄疸肝纤维化，提示梗阻性黄疸减弱了肝脏NK细胞的抗肝纤维化作用，推测其机制可能与HSC活化增多及梗阻性黄疸抑制了肝脏NK细胞对活化的HSC的杀伤作用有关。

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中英文缩略词表

1 前言

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 小鼠梗阻性黄疸模型建立

2.3 实验分组及干预方法

2.4 一般情况观察与标本采集

2.5 肝功能检测

2.6 肝组织病理学检查

2.7 实时荧光定量聚合链反应检测

2.8 统计学分析

3 结 果

3.1 小鼠一般情况及死亡率

3.2 小鼠体重变化

3.3 小鼠肝功能指标

3.4 小鼠肝质比与肝脏大体标本

3.5小鼠肝脏HE染色

3.6 小鼠第7天肝脏NF-κB免疫染色与NF-κB mRNA表达量

3.7 术后第14天小鼠肝脏Masson三染色

3.8 术后第14天小鼠肝脏α-SMA免疫染色与α-SMA mRNA表达量

3.9 小鼠肝脏TNF-α、NK 1.1 与TRAIL mRNA表达量

4 讨论

5 结论

参考文献

综述: 肝脏自然杀伤细胞：免疫生物学及其在肝脏疾病中的作用

个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢