小麦品质相关γ类醇溶蛋白基因TaWG04的克隆与表达分析

摘要

普通小麦及其近缘属物种中均含有丰富的醇溶蛋白，这些麦醇溶蛋白基因与小麦品质性状显著相关，克隆醇溶蛋白基因并对其进行表达与功能分析，是研究醇溶蛋白分析结构及其与品质关系的有效途径。本文以优质强筋小麦郑麦366与典型弱筋小麦郑麦004为实验材料，利用转录组测序数据分析结合Real-time PCR技术筛选差异表达基因，分离克隆出一个胚乳特异性表达的对小麦品质起负效应的γ-醇溶蛋白多基因 TaWG04，并分析了该基因的表达调控模式。
　　主要结果如下：
　　（1）通过转录组测序分析，筛选到10个在弱筋小麦郑麦004中强表达的醇溶蛋白基因。Real-time PCR进一步验证，获得7个醇溶蛋白基因在弱筋小麦郑麦004中强表达，其中TaWG04和TaWG05编码γ-醇溶蛋白基因在强筋品种郑麦366中表达量最低。
　　（2）通过cDNA末端快速扩增技术克隆TaWG04基因全长，得到1144bp的片段，其中包含有5’端序列101bp，3’端序列68bp，和一个975bp的完整开放读码框（A6），编码324个氨基酸，其中包含有21个氨基酸数目的信号肽序列。
　　（3）通过生物信息学寻找TaWG04基因的同源序列，根据同源序列保守区域设计3对引物，进行克隆测序，共获得33条基因序列，推导氨基酸序列结构特征并构建系统发育树。结果发现F25基因提前终止，推测为假基因，其余序列中均含有8个半胱氨酸残基，具有典型的γ-醇溶蛋白结构特征。
　　（4）通过Real-time PCR分析TaWG04基因在种子发育不同阶段（授粉后7天、14天、21天、28天与35天）与不同部位（露白48h、幼苗7天、根、茎、叶、雄蕊、雌蕊、胚与胚乳）的时空表达特征，结果表明该基因只在胚乳中表达，并可以在授粉14天时检测到表达量，随后逐步增强，28天时达到最大量，随后表达量减少。
　　（5）选择典型强筋类品种师栾02-1、西农979、新麦26、郑麦366、郑麦9023以及非强筋类品种矮抗58、焦麦266、豫麦13、鄂麦352、郑麦004、周麦13品种进行Real-time PCR分析，发现TaWG04基因在强筋品种中表达普遍受到抑制，表明TaWG04可能负调控小麦的强筋品质。
　　（6）根据A6设计不扩增信号肽的表达引物，回收目的片段与pET32a载体分别用BamH I和HindШ进行双酶切，连接转化到受体菌E.coli Rosetta(DE3)中，成功地构建原核表达载体pET-32a-γ-A6，测序验证后进行IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳检测与亲和层析纯化，最终获得目的蛋白浓度为4mg/ml并且确定蛋白位于包涵体中。
　　（7）制备多克隆抗体与Western Blotting检测，最终获得抗体的浓度为1.33mg/ml，能特异性的识别重组蛋白，大小在55kd左右，与抗原蛋白表达情况基本相符，具有良好的免疫原性。
　　（8）选择强筋类小麦品种郑麦366，西农979，陕优225与弱筋类小麦品种周8425B，周麦9号，矮抗58，周麦16，周麦13等进行Western Blotting分析，结果表明在强筋类小麦品种中该蛋白基本不表达，而弱筋类小麦品种中均含有该蛋白，与前期Real-time PCR检测结果相吻合。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 文献综述

1.1 小麦醇溶蛋白现状

1.2 醇溶蛋白与品质关系

1.3 氨基酸序列结构特征

1.4 基因克隆方法

1.5 表达分析

第二章 醇溶蛋白基因筛选

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

第三章 TaWG04基因克隆与表达分析

3.1材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

第四章 原核表达与抗体制备

4.1 材料与试剂

4.2 方法

4.3 结果与分析

第五章 讨论

5.1 醇溶蛋白基因在强筋小麦郑麦366中表达受到抑制

5.2 TaWG04基因属于γ类多基因醇溶蛋白

5.3 TaWG04基因在胚乳中特异表达

5.4 TaWG04基因对强筋品质具有负效应

5.5 醇溶蛋白基因的应用

致谢

个人简历

参考文献