慢病毒介导的HDAC1基因沉默对hUC-MSCs神经分化和TBI治疗的促进作用

摘要

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是一种致死致残率极高的中枢神经系统（central nervous system，CNS）损伤性疾病，给患者、家庭社会带来严重的负担。TBI的病理机制、影响因素复杂且不统一。近年来，干细胞替代疗法为CNS损伤疾病的治疗带来希望。脐带源性间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell，hUC-MSC)是一类具有强大增殖分化能力且伦理争议小的干细胞，具有极大的临床应用价值。但是干细胞在体内存活和分化效率低是干细胞治疗的瓶颈。因此，探讨更为安全、有效的诱导分化方式对于干细胞移植治疗TBI尤为关键。
　　表观遗传学是研究核苷酸序列不变，但是基因表达发生有效调控的一门学科。组蛋白乙酰化修饰是一种常见的表观遗传学修饰方法，它通过改变细胞内乙酰化酶（HAT）和去乙酰化酶（HDAC）的动态平衡来调控干细胞的增殖和定向分化。研究表明，与未分化的干细胞相比，已分化的成熟神经元中HDAC1的表达量降低。HDAC1、HDAC2与其他因子组成阻遏复合物共同调控了干细胞的增殖和分化，而敲除HDAC2可能会抑制神经祖细胞的增殖。因此，深入研究HDAC1在干细胞神经分化和神经修复中的作用和机制，对于治疗 CNS损伤性疾病十分必要。
　　目的：
　　本课题以HDAC1为研究靶点，通过体外实验研究慢病毒介导shRNA靶向下调HDAC1的表达对 hUC-MSCs增殖和神经分化的影响；然后通过体内实验评价LV-HDAC1shRNA感染的MSCs对TBI小鼠的神经修复和保护作用。该研究旨在揭示HDAC1在调控hUC-MSCs神经分化中的作用机制，为开展干细胞分化的表观遗传学调控和提高干细胞对神经系统疾病的临床治疗效果奠定基础。
　　方法:
　　1.体外实验研究慢病毒介导shRNA下调HDAC1表达对hUC-MSCs增殖和向神经元样细胞分化的影响
　　采用组织贴壁法分离培养hUC-MSCs；筛选靶向下调HDAC1表达的shRNA片段，合成慢病毒感染干细胞，建立稳定的慢病毒感染细胞株。实验分为LV-HDAC1shRNA组和hUC-MSCs组。CCK-8检测各组细胞的增殖、流式细胞术检测各组细胞的周期、qRT-PCR、Western Blot检测各组细胞神经分化相关基因在mRNA和蛋白水平的表达、免疫细胞化学检测各组细胞在神经诱导微环境下神经元迁移蛋白(Doublecortin，DCX)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)的表达。
　　2.体内实验研究LV-HDAC1shRNA感染的hUC-MSCs对TBI小鼠的神经修复作用
　　80只C57/BL6J小鼠利用脑立体定位仪和颅脑打击器制作小鼠皮质损伤创伤性脑损伤（TBI）模型，随机分为Sham组、Vehicle组、MSCs组+NCshRNA、MSCs+shRNA组（每组20只）。CV染色评估小鼠脑损伤体积；采用干湿重法检测TBI后脑水肿情况；采用mNSS评分评估小鼠神经功能缺损情况；采用Morris水迷宫法、新事物识别实验检测小鼠的学习记忆能力；采用酶联免疫吸附实验检测小鼠血清中的SOD、MDA、GSH、GSH-Px、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的表达情况；采用qRT-PCR、Western Blot分别检测小鼠病灶部位神经分化相关基因表达变化和损伤部位乙酰化水平。
　　结果:
　　1.与对照组相比，LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSCs后HDAC1的表达下调，而H3K9Ac表达增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；LV-HDAC1 shRNA在3d后可明显促进hUC-MSCs的增殖，增加S期细胞比例（P<0.05）；在相同神经诱导分化条件下LV-HDAC1 shRNA组神经分化效率增加，细胞中DCX、NSE的表达明显升高（P<0.05），而神经分化相关基因（Ngn2、Mash1等）的表达显著增加（P<0.05）。
　　2.成功建立TBI小鼠模型；通过Morris水迷宫、新事物识别实验、脑含水量检测发现，与Vehicle组相比，MSCs+NCshRNA组、MSCs+shRNA组学习、记忆能力明显改善（P<0.05）、脑水肿体积显著减小（P<0.05）；ELISA结果显示各治疗组28d血清中的SOD、GSH、GSH-Px、IL-4、IL-10的表达显著增加（P<0.05），而MDA、TNF-α、IL-1β的表达明显降低（P<0.05）；Western Blot结果显示：术后14d，与Vehicle组相比，MSCs+shRNA组小鼠损伤部位乙酰化水平增加明显（P<0.05）。qRT-PCR结果显示：术后28d，较Vehicle组，MSCs+shRNA组病灶部位神经分化相关基因DCX、MAP2和海马中神经营养因子BDNF、NGF、NT3的表达均有明显上调（P<0.05）。
　　结论:
　　1. LV-HDAC1 shRNA感染hUC-MSC后，HDAC1的表达被靶向下调、细胞乙酰化水平提高。同时，细胞增殖变快、S期细胞比例增加，调控神经发育相关基因的表达上调，有效促进了hUC-MSCs向神经元样细胞分化。
　　2. LV-HDAC1 shRNA能够提高损伤部位hUC-MSCs的神经分化能力和乙酰化水平，减轻脑水肿和炎症反应，改善病灶的抗氧化能力，进而促进hUC-MSCs移植对TBI小鼠的神经修复。

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缩略词

引言

第一部分 慢病毒介导的shRNA下调HDAC1表达对hUC-MSCs增殖和神经分化的影响

前言

1.1 材料与方法

1.1.1 主要试剂

1.1.2 脐带组织标本的获取

1.1.3 hUC-MSC的分离、培养、冻存及传代

1.1.4 hUC-MSC细胞表面抗原检测

1.1.5 高效shRNA干扰片段的筛选及重组慢病毒的合成

1.1.6 重组慢病毒复感染指数的筛选及稳定细胞系的建立

1.1.7 CCK-8法检测细胞增殖情况

1.1.8 PI染色检测细胞周期情况

1.1.9 重组慢病毒LV-HDAC1shRNA感染hUC-MSCs细胞后的成神经分化情况

1.1.10 统计学分析

1.2 结果

1.2.1 不同时期hUC-MSCs的显微结构

1.2.2 hUC-MSCs表面标记物的鉴定

1.2.3 靶向下调HDAC1表达的shRNA片段的筛选

1.2.4 确立合适的MOI值及建立LV-HDAC1shRNA稳定细胞系

1.2.5 重组慢病毒LV-HDAC1shRNA对P5代 hUC-MSCs细胞增殖的影响

1.2.6 重组慢病毒LV-HDAC1shRNA对hUC-MSCs乙酰化水平的影响

1.2.7 重组慢病毒LV-HDAC1shRNA对hUC-MSCs细胞周期的影响

1.2.8 重组慢病毒LV-HDAC1shRNA诱导hUC-MSCs向神经分化的情况

1.3 讨论

1.4 小结

第二部分 LV-HDAC1 shRNA的感染hUC-MSCs对TBI小鼠的神经修复作用

前言

2.1 材料与方法

2.1.1 动物来源

2.1.2 主要试剂

2.1.3 实验动物分组

2.1.4 TBI脑损伤动物模型的建立及侧脑室移植

2.1.5 小鼠死亡率统计和生理体征观察

2.1.6 小鼠神经功能缺损情况的评估

2.1.7 小鼠学习记忆能力评估

2.1.8 小鼠脑含水量检测

2.1.9 小鼠主动脉灌流和脑切片制备

2.1.10 小鼠脑损伤体积检测

2.1.11 Elisa检测小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的表达

2.1.12 Elisa检测小鼠血清中GSH-Px、GSH、SOD、MDA的表达

2.1.13 Western Blot检测细胞移植后小鼠脑损伤部位乙酰化水平

2.1.14 qRT-PCR检测小鼠神经分化相关基因与神经营养因子的表达情况

2.1.15 统计学分析

2.2 结果

2.2.1 术后各组小鼠的致死及体重变化情况

2.2.2 术后各组小鼠的脑损伤体积变化情况

2.2.3 术后各组小鼠的脑含水量的比较

2.2.4 术后各组小鼠脑损伤部位乙酰化水平的比较

2.2.5 术后小鼠血清中炎症相关因子表达的比较

2.2.6 术后小鼠血清中氧化应激相关因子表达的比较

2.2.7 术后小鼠神经功能的恢复情况

2.2.8 术后小鼠学习认知水平的恢复情况

2.2.9 术后各组小鼠神经分化相关基因与神经营养因子的表达情况

2.3 讨论

2.4 小结

结论

参考文献

综述组蛋白去乙酰化酶与神经修复

附录 实验主要设备及耗材

个人简历

致谢