下调Smac通过内质网应激对人晶状体上皮细胞凋亡的影响研究

摘要

背景:
　　白内障是世界范围内造成人类致盲的主要眼病。老龄人口的增长导致患病率也逐年上升。目前白内障复明的主要方法是手术治疗。白内障手术的普及和人工晶状体不断地更新和完善给千百万白内障患者重新带来光明，并且国家每年出资委派医疗队为贫困白内障患者免费手术治疗，这无疑增加社会的经济负担。由于我国人口基数大，部分偏远地区医疗条件差以及手术费用昂贵等诸多原因，仍有部分白内障患者无法得到有效的手术治疗。因此研究白内障的发病机理对防治和延缓白内障的发生发展具有重要意义。内质网在人体内发挥重要的调节代谢作用，当机体受到外界刺激，机体内环境发生相应改变，为对抗这种刺激便会诱发内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS），然而过强的ERS就会造成细胞损伤引起凋亡。近几年有不少学者研究ERS与年龄相关性白内障的发病机制相关。我们前期实验验证Smac高表达与晶状体混浊有关，然而缺乏进一步研究和探讨，本实验主要分为两个方面研究，一方面是探讨Smac与年龄相关性白内障晶状体混浊是否有关，另一方面是拟下调Smac表达后通过内质网应激途径对人晶状体上皮细胞产生的影响。
　　目的:
　　1.探讨Smac是否与白内障发生有关。
　　2.研究Smac通过内质网应激途径对人晶状体上皮细胞的影响。
　　方法:
　　1.于本院收集人晶状体前囊膜组织，收集157例（169只眼）年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜片及5例正常人（10只眼）捐献的晶状体前囊膜。白内障患者晶状体的混浊类型根据Emery核硬度分级标准，检测Smac在人类晶状体前囊表达，并采用HE染色和免疫组化半定量法分析Smac和白内障发生发展的关系。
　　2.选取对数期细胞株，通过RNA干扰技术使Smac的表达下调。用H2O2诱导内质网应激，实验分为四组：PBS组、H2O2组、siRNA-NC+H2O2组，siRNA-Smac+H2O2组。
　　3.转染进行24h后采用蛋白印迹法（Western blot）筛选出最佳干扰质粒。
　　4. CCK-8法（Cell Counting Kit-8）筛选出合适的H2O2浓度诱导细胞凋亡率接近50％，并检测下调Smac的表达后对人晶状体上皮细胞活力的影响。
　　5.转染进行24-36h后，运用Annexin V-APC/PI法检测PBS组、H2O2组、siRNA-NC+H2O2组，siRNA-Smac+H2O2组的细胞凋亡率。
　　6.逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR， RT-PCR)检测各组GRP78、CHOP、BAX/Bcl-2及caspase-3在mRNA水平的表达情况。
　　7. Western Blot检测GRP78，CHOP，Bax/Bcl-2及cleaved caspase-3检测蛋白的表达情况。
　　结果:
　　1.免疫组化半定量结果表明，ARC患者的前囊膜中Smac的表达高于正常人对照组，轻度和中度白内障患者中Smac的表达与晶状体混浊没有统计学差异，重度和全白的白内障患者中晶状体混浊程度越重，Smac表达的阳性率越高。
　　2．筛选出最佳干扰质粒为siRNA-Smac3，能够有效下调Smac的表达。
　　3．CCK-8法检测出细胞凋亡率接近50%的H2O2的浓度为200μmol/L，作用时长为24h，下调Smac可增加LECs的细胞活力。
　　4．流式细胞仪检测各组凋亡率依次为PBS组（1.7±1.2）%、H2O2组（40.1±3.9）%、siRNA-NC+H2O2组（45.3±4.4）%，siRNA-Smac+H2O2组的凋亡率（26.5±2.8）%，与H2O2组相比，Smac的下调能够使凋亡率下降（P<0.05）
　　5．RT-PCR检测出siRNA-Smac+H2O2组比较H2O2组中的GRP78、CHOP、caspase-3及BAXmRNA表达减弱，Bcl-2在mRNA水平表达上调。
　　6. Western blot检测各组细胞结果显示Smac下调后GRP78、CHOP、cleaved caspase-3、Bax蛋白水平的表达下降，Bcl-2相应增多。
　　结论:
　　Smac与年龄相关性白内障密切相关，下调Smac的表达能够抑制内质网应激途径阻止人晶状体上皮细胞的凋亡。

目录

声明

中英文缩略词

前言

材料和方法

1 实验材料与设备

2 实验方法

结果

1 Smac在人晶状体前囊膜上的表达

2 人晶状体上皮细胞的培养

3 通过RNA干扰技术下调Smac的表达

4 H2O2最佳作用浓度的筛选

5 CCK-8检测Smac对LECs细胞活力的影响

6 Annexin V-APC/PI双染后流式细胞仪检测siRNA-Smac对LECs凋亡的影响

7 Smac 下调后对 H2O2处理过后对 LECs 中 GRP78、CHOP 及BAX/BCl-2 mRNA水平表达产生的影响

8 Western blot 检测 GRP78、CHOP、cleaved caspase-3 及BAX/Bcl-2蛋白水平表达情况

讨论

结论

参考文献

综述:内质网应激在眼科相关疾病发生发展中研究进展

个人简历、在校期间发表的文章

致谢