Smac对人晶状体上皮细胞增生的抑制作用及促凋亡作用

摘要

背景 晶状体后囊膜混浊（PCO）是囊外白内障摘出术后的主要并发症，其发病机制与晶状体上皮细胞（LECs）的增生、移行和上皮－间质转化（EMT）有关，探讨相关的预防和靶向治疗措施至关重要。目的 探讨Smac对人LECs增生和凋亡的作用及防治PCO的生物学作用。方法 对HLE-B3细胞株及Smac过表达人LECs株进行培养，将培养的HLE-B3细胞分为PBS组、空质粒转染组和siRNA-Smac3转染组，分别将PBS、空质粒载体和带有增强型绿色荧光蛋白（GFP）的siRNA-Smac3质粒转染细胞24 h，计算siRNA-Smac3质粒转染率。在细胞培养液中分别添加不同质量浓度（5、10、20和50 μg/ml）TGF-β2或200 μmol/L H2O2以建立PCO模型或氧化应激凋亡模型。将细胞分为PBS组、TGF-β2组和Smac过表达＋TGF-β2组，采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞增生活力；将细胞分为PBS组、H2O2组和siRNA-Smac＋H2O2组，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；分别采用实时定量PCR和Western blot法检测培养的细胞中Smac、caspase-3及增生细胞核抗原（PCNA）mRNA及蛋白的相对表达量。结果 siRNA-Smac3质粒转染细胞后GFP阳性细胞达80%以上，荧光定量PCR筛选出最佳干扰质粒为siRNA-Smac3。siRNA-Smac3转染组GFP阳性细胞率为（72.32±2.31）%，明显高于空质粒载体组的（4.91±0.24）%，差异有统计学意义（t＝116.342，P〈0.001）。LECs中Smac mRNA相对表达量为35.21±4.11，高于空质粒载体组的15.24±2.48，差异有统计学意义（t＝215.47，P〈0.05）。20 μg/ml TGF-β2作用后PBS组、TGF-β2组和Smac过表达＋TGF-β2组的细胞增生率分别为（98.4±1.7）%、（98.9±0.1）%和（64.2±3.1）%，Smac过表达＋TGF-β2组明显低于TGF-β2组，差异有统计学意义（P〈0.05）。PBS组、H2O2组和siRNA-Smac＋H2O2组细胞凋亡率分别为（2.9±1.2）%、（45.1±4.5）%和（27.5±1.8）%，siRNA-Smac＋H2O2组细胞凋亡率明显低于H2O2组，差异有统计学意义（P〈0.05）。荧光定量PCR结果显示，PBS组、H2O2组和siRNA-Smac＋H2O2组caspase-3 mRNA相对表达量分别为0.321±0.103、0.715±0.112和0.479±0.209，siRNA-Smac＋H2O2组细胞中caspase-3 mRNA相对表达量明显低于H2O2组，差异有统计学意义（P〈0.05）；PBS组、TGF-β2组和Smac过表达＋TGF-β2组细胞中PCNA mRNA相对表达量分别为0.299±0.013、0.645±0.102和0.490±0.209，与TGF-β2组比较，Smac过表达＋TGF-β2组细胞中PCNA mRNA相对表达量明显下降，差异有统计学意义（P〈0.05）。Western blot结果显示，caspase-3蛋白在siRNA-Smac＋H2O2组和H2O2组相对表达量为0.712±0.012和0.973±0.051，siRNA-Smac＋H2O2组细胞中caspase-3蛋白的相对表达量明显低于H2O2组，差异有统计学意义（t＝132.52，P〈0.05）；PCNA在Smac过表达＋TGF-β2组和TGF-β2组，相对表达量为0.782±0.212，相对表达量为1.126±0.251，Smac＋TGF-β2组PCNA蛋白相对表达量显著低于TGF-β2组，差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 Smac基因抑制人LECs株HLE-B3细胞系的增生并促进细胞的凋亡，其可能用于防治PCO。