基因工程菌全细胞催化制备葡甘低聚糖

摘要

葡甘低聚糖是一种水溶性的高分子多糖，它作为功能性低聚糖，可以改善动物肠道微生物菌群，提高机体的免疫功能及抗氧化性等，广泛应用于食品、药品以及饲料行业。其特殊的生理功能和广泛的应用前景，极大地引起了学者们的兴趣。本文通过含有β-甘露聚糖酶基因的重组工程菌利用全细胞催化的方式制备葡甘低聚糖，并对其酶解工艺条件进行响应面优化，之后对酶解产物进行薄层色谱和高效液相检测，并对酶解产物进行脱色和去单糖处理。
　　Rossate-pET32a-CH3是本实验室构建的含有β-甘露聚糖酶基因的重组工程菌，酶活力较高。该重组工程菌利用全细胞催化的方式水解魔芋粉制备葡甘低聚糖，通过单因素优化分析，探究不同酶解温度、酶解时间、pH值、底物浓度以及加酶量对魔芋粉水解率的影响。单因素优化结果显示，酶解反应的最佳温度为50℃，最佳时间为12h，最佳pH值为7.0，最佳底物浓度为3％，最佳酶量为1000 U。由于酶解时间和加酶量这两个因素对魔芋粉水解率的影响显著性不明显，选取反应温度(A)、底物浓度(B)、pH值(C)为三个变量，以酶解反应的水解率Y为响应面值，利用Design-Expert软件根据Box-Behnken的原理设计试验方案，并进行试验和统计分析，最终确定了利用全细胞催化方式水解魔芋粉的最佳工艺条件:反应温度为50.6℃，底物浓度为3.4％，pH值为6.8。使得最终的魔芋粉水解率达到了41.34％，与预测值41.541％相吻合。
　　薄层色谱法(TLC)检测具有成本低，检测速度快，操作简便等优点，因此，本研究对酶解产物的检测采用薄层色谱法进行。根据响应面优化得到的最佳酶解工艺条件，制备葡甘低聚糖。将反应结束后的酶解液离心取上清，与含有甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖的标准品混合液分别点样于Sillca gel60硅胶板中，进行薄层色谱分析。分析结果显示，酶解产物中主要成分为甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖，不含有或者含有极少量的单糖;高效液相色谱分析显示产物只占总物质含量的22.64％。
　　利用酵母发酵的方式去除酶解产物中含有的单糖，并通过单因素优化和正交试验优化，探究酵母去除单糖的最佳条件。单因素优化结果显示，酵母去除单糖的最佳条件:发酵时间为22 h，底物浓度为2％，酵母添加量为2％。经过正交试验后，优化结果显示，这三个因素对单糖去除率影响程度逐次排序为:底物浓度(C)＞发酵时间(A)＞酵母添加量(B)。酵母去除单糖的最佳条件为C3A1B2，即发酵时间24 h，底物浓度1％，酵母添加量2％。在最佳条件下，单糖去除率达到了69.50％。
　　利用活性炭粉末的强力、高效的吸附性对酶解产物进行脱色研究，通过单因素优化试验探究了不同活性炭用量、脱色时间、脱色温度对活性炭脱色率和糖保留率的影响。优化结果显示，选取0.4％的活性炭用量、1h的脱色时间、70℃的脱色温度效果较好。在最佳条件下，活性炭的脱色率为88.53％，糖保留率为85.43％。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 立题背景

1．2 葡甘低聚糖

1．2．1 葡甘低聚糖的来源

1．2．2 葡甘低聚糖的结构、理化性质

1．2．3 葡甘低聚糖的生理功能

1．2．4 葡甘低聚糖的应用

1．3 葡甘低聚糖制备的国内外研究进展

1．3．1 葡甘低聚糖的制备

1．3．2 β-甘露聚糖酶

1．3．3 葡甘低聚糖的分离纯化

1．3．4 葡甘低聚糖的检测

1．3．5 基因工程菌Rossate-pET32a-CH3

1．3．6 全细胞催化

1．4 本课题研究的目的、意义和研究内容

1．4．1 研究目的和意义

1．4．2 研究内容

第二章 全细胞催化制备葡甘低聚糖水解工艺条件研究

2．1 引言

2．2 材料和设备

2．2．1 试验材料

2．2．2 试剂配制

2．3 试验方法

2．3．1 β-甘露聚糖酶活力的测定

2．3．2 魔芋粉总糖的测定

2．3．3 魔芋粉水解率的测定

2．3．4 葡甘低聚糖制备条件优化试验设计

2．4 结果与分析

2．4．1 D-甘露糖标准曲线

2．4．2 魔芋粉总糖含量测定

2．4．3 魔芋粉酶解的单因素试验

2．4．4 魔芋粉酶解的响应面试验

2．5 讨论

第三章 酶解产物的检测

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 酶解产物的制备

3．2．3 酶解产物的薄层色谱检测分析

3．2．4 酶解产物的高效液相色谱分析

3．3 结果与分析

3．3．1 酶解产物的薄层色谱结果

3．2．2 酶解产物的高效液相色谱结果

3．4 讨论

第四章 葡甘低聚糖的去除单糖和脱色工艺

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 试验材料

4．2．3 葡甘低聚糖干粉的制备

4．2．4 葡甘低聚糖单糖去除

4．2．5 葡甘低聚糖脱色

4．3 结果与分析

4．3．1 葡甘低聚糖单糖去除

4．3．2 葡甘低聚糖脱色

4．5 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

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