Elp3的缺失对酿酒酵母咖啡因、过氧化氢耐受性的影响

摘要

过量咖啡因对所有真核细胞都有毒害性。Elongator复合物是六亚基组蛋白乙酰转移酶复合物，具有功能完整性。其催化亚基Elp3可特异地乙酰化组蛋白H3第14位(H3K14)和组蛋白H4第8位上(H4K8)的赖氨酸，该亚基缺失或减弱其HAT活性的点突变都可影响Elongator功能，使酵母产生对咖啡因等敏感表型。Elp3不仅参与基因转录过程，还参与细胞的极性运输及tRNA修饰。为深入研究Elp3缺失对酿酒酵母咖啡因耐受性的影响，以野生型(WT)、elp3△、elp1△、H3K14R/elp3△和H3K14R/H4K8R/elp3△及转入完整和部分缺失ELP3的转化株为材料，对不同浓度咖啡因处理的各菌株进行了敏感性检测和生长曲线绘制。结果表明elp1△和elp3△菌株都对咖啡因敏感，且两者表型相似;咖啡因胁迫下两保守结构域缺失的elp3△转化株的生长情况与elp3△菌株相似，而酵母ELP3全长基因的elp3△转化株与WT表型相似;另外，H3K14和H4K8这两个位点突变会降低酵母的咖啡因耐受性，转入相同基因的组蛋白突变转化株的咖啡因极限浓度小于组蛋白野生的elp3△相应转化株。
　　因为高温协同处理降低了各菌株咖啡因耐受性的极限浓度。故通过qRT-PCR实验研究咖啡因胁迫下各菌株内三类功能不同的热激蛋白基因（HSP26、SSA3、HSP82）的表达情况，结果表明Elp3亚基或其两保守结构域的缺失严重影响三类热激蛋白的表达，而酵母ELP3全长基因的转入在很大程度上补偿了elp3△菌株在基因转录方面的缺陷。但在H3K14和H4K8这两位点突变的情况下，酵母ELP3全长基因对三类热激蛋白基因的转录几乎无补偿作用。上述结果表明Elp3及其两保守结构域缺失可降低酿酒酵母的咖啡因耐受性，Elp3缺失对咖啡因耐受性的影响可能与其应激基因表达受阻有关。
　　已知Elp3可修饰tRNA，且tRNALysUUU和tRNAGlnUUG过表达最能补偿Elp3亚基的缺陷功能。为了探究Elp3的tRNA修饰功能是否参与咖啡因胁迫条件下酿酒酵母的生存，我们将这两种过表达质粒分别转入各菌株并进行咖啡因敏感实验。结果表明这两种tRNA的过表达对各菌株的咖啡因耐受性几乎无影响。表明Elp3并非通过其对翻译的影响而参与酿酒酵母的咖啡因胁迫应答。
　　过氧化氢是科学研究常用的一种氧化剂，其胁迫下细胞会发生氧化应激反应。为研究Elp3与氧化应激的关系，我们以上述菌株为材料，采用类似方法对各菌株的过氧化氢耐受性进行检测。结果表明Elp3可影响酵母总蛋白含量和超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性，降低酿酒酵母的过氧化氢耐受性;在H3K14和H4K8这两位点突变的情况下，HAT域对酵母氧化应激反应的影响力高于SAM域。通过qRT-PCR研究各菌株的三类热激蛋白基因（HSP26、SSA3、HSP82）的表达情况，结果表明过氧化氢胁迫下，各菌株的热激蛋白表达升高，Elp3亚基或其两保守结构域的缺失严重影响三类热激蛋白的表达，而酵母ELP3全长基因的转入在很大程度上补偿了elp3△菌株在基因转录方面的缺陷。但H3K14和H4K8两位点的突变严重削弱了各ELP3基因对热激蛋白等应急基因表达的补偿作用。另外，tRNALysUUU和tRNAGlnUUG过表达能在一定程度上缓解各菌株对过氧化氢的敏感性。表明Elp3可能通过其转录、翻译功能影响应激基因表达而参与酿酒酵母的氧化应激反应。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 Elongator复合物研究进展

1．1．1 Elongator复合物的发现与组成

1．1．2 Elongator复合物的功能

1．2 酵母咖啡因耐受性的研究

1．3 酵母菌的氧化应激反应

1．3．1 活性氧与氧化应激

1．3．2 酿酒酵母的氧化应激反应

1．4 研究目的和意义

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 引物设计

2．1．3 试剂和培养基

2．1．4 试剂盒

2．1．5 主要仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 大肠杆菌的感受态细胞制备和质粒转化

2．2．2 质粒的提取

2．2．3 酵母转化

2．2．4 敏感性试验和功能互补实验

2．2．5 生长曲线的绘制

2．2．6 酵母菌粗蛋白的提取

2．2．8 RNA的提取

2．2．9 基因表达分析

第三章 Elp3的缺失对酵母菌咖啡因耐受性的影响

3．1 ELP3的组蛋白乙酰化作用对酵母咖啡因耐受性的影响

3．1．1 elp△菌株的敏感性实验

3．1．2 elp3△菌株的生长曲线

3．1．3 elp3△菌株的功能补偿实验

3．1．4 组蛋白乙酰化位点突变兼ELP3缺失菌株的功能补偿实验

3．1．5 组蛋白乙酰化位点突变兼ELP3缺失菌株的生长曲线

3．1．6 HSP26、SSA3、HSP82基因表达分析结果

3．2 Elp3的tRNA修饰作用在酵母咖啡因耐受性的影响

第四章 Elp3的缺失对酵母菌氧化应激反应的影响

4．1 ELP3的组蛋白乙酰化作用对酵母氧化应激反应的影响

4．1．1 elp△菌株的敏感性实验

4．1．2 elp3△菌株的生长曲线

4．1．3 elp3△菌株的功能补偿实验

4．1．4 组蛋白乙酰化位点突变兼ELP3缺失菌株的功能补偿实验

4．1．5 组蛋白乙酰化位点突变兼ELP3缺失菌株的生长曲线

4．1．6 H2O2对elp3△菌株的胞质蛋白浓度、CAT和SOD活力的影响

4．1．7 HSP26、SSA3、HSP82基因表达分析结果

4．2 Elp3的tRNA修饰作用对酵母氧化应激反应的影响

第五章 讨论

5．1 Elongator复合物的功能完整性

5．2 Elp3及其两保守结构域与酿酒酵母的咖啡因耐受性

5．3 Elp3及其两保守结构域缺失对酿酒酵母氧化应激反应的影响

第六章 结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果

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