猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抑制RNA诱导的基因沉默

摘要

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是一种由双链RNA(double-strand RNA，dsRNA)启动的序列特异性基因沉默机制。RNAi从线虫到人类细胞都广泛存在，是一种先天性抗病毒的自我防御方式，能够抵抗外源基因或病毒的入侵。然而，病毒在受到RNAi抵抗过程中会通过病毒蛋白或非编码的病毒RNA来抑制RNA沉默，即RNA沉默抑制子(RNA silencing suppressor，RSS)，从而使病毒在宿主细胞内复制、增殖，促进病毒感染。目前，已从植物、动物和人类病毒中鉴定了20多种RSSs，并且这些RSSs中大部分都是干扰素的拮抗蛋白。
　　猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为主要特征的病毒性疾病，给养猪业造成重大的经济损失。PRRS是由PRRSV引起的，PRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒属(Arterivirus)，动脉炎病毒科，套式病毒目(Nidoviruses)。基因组全长约15kb，含有9个开放性阅读框(ORFs)，其中，ORF-1编码14中非结构蛋白(nsps)，nsps除了具有复制、蛋白酶、聚合酶的功能外，同时还能抑制干扰素的产生;ORF2-7编码病毒的结构蛋白。
　　RNAi作为宿主细胞抑制病毒复制、清除病毒的一种先天性免疫机制，是宿主重要的免疫防御系统，许多持续性感染的病毒都存在一定的机制拮抗RNA诱导的基因沉默。PRRSV存在免疫抑制和持续性感染的免疫学特性，并且PRRSV的感染能抑制干扰素的产生，表明PRRSV可能会存在抑制RNA诱导的基因沉默的作用，从而逃避宿主先天性的抗病毒免疫。
　　本研究利用RNAi技术，将人工合成的dsRNA和shRNA、mi-RNA干扰表达质粒分别转染MARC-145细胞，dsRNA、shRNA和mi-RNA靶向的目标基因是萤火虫荧光素酶报告基因(Luciferase，Luc)，经双荧光素酶报告检测系统检测，发现dsRNA、shRNA和mi-RNA均抑制了转染的细胞Luc的表达量，表明在MARC-145细胞上成功构建了dsRNA、shRNA和mi-RNA诱导的基因沉默的模型;PRRSV与RNAi模型共作用于MARC-145细胞，发现PRRSV能够恢复被抑制的Luc的表达量，证实PRRSV能够抑制RNA诱导的基因沉默;PRRSV的nsp1和nsp11分别与RNAi模型共转染MARC-145细胞，nsp1和nsp11同样也能恢复被抑制的Luc的表达量，其中，nsp1可以自水解为nsp1α和nsp1β，nsp1能够恢复被抑制基因表达量主要是通过nsp1α实现的，nsp1α和nsp11可能是RNA沉默抑制子;分别构建nsp1α和nsp11的突变体使nsp1α的木瓜蛋白酶活性和nsp11的核酸内切酶活性都失活，nsp1α和nsp11的突变体分别与RNAi模型共转染MARC-145细胞，然而，这些突变体不能抑制RNAi诱导的基因沉默，这揭示nsp1α的木瓜蛋白酶活性和nsp11的核酸内切酶活性对nsp1α和nsp11发挥RSS活性起关键性作用。
　　在MARC-145细胞上，PRRSV抑制了shRNA、 dsRNA和miRNA诱导的RNA沉默，并且PRRSV的非结构蛋白nsp1和nsp11具有抑制RNA诱导的基因沉默的作用，nsp1α和nsp11是RNA沉默的抑制子，nsp1α的木瓜样蛋白酶的活性和nsp11的核酸内切酶活性分别是nsp1α和nsp11发挥抑制RNA诱导的基因沉默活性所必需的。

目录

声明

致谢

摘要

第一部分 文献综述

1 病原学

2 PRRSV分子生物学

2．1 PRRSV基因组结构

2．2 PRRSV编码的非结构蛋白及其功能

2．3 PRRSV编码的结构蛋白及其功能

3 PRRSV免疫学研究进展

3．1 PRRSV免疫调节和免疫逃逸

3．2 PRRSV免疫抑制

3．3 PRRSV疫苗

4 RNAi研究进展

4．1 RNAi机制

4．2 RNAi是一种抗病毒免疫反应

4．3 RNAi一基因调控的工具

5 RNA沉默抑制子(RNA Silencing suppressor RSS)的研究进展

5．1 HIV的Tat蛋白介导RNA沉默抑制

5．2 人类A型 流感病毒的NS1蛋白作为RSS

5．3 丙型肝炎病毒的核蛋白和外膜蛋白(E2)作为RSS

5．4 埃博拉病毒的VP35作为RSS

5．5 痘病毒的EL3蛋白作为RSS

5．6 腺病毒非编码RNA作为RSS

6 本研究的意义

引言

第二部分 在MARC-145上构建RNA干扰的模型及其干扰效果鉴定

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 检测shRNA干扰表达载体的有效性

2．2 检测mi-RNA干扰表达载体的有效性

2．3 检测人工合成的双链dsRNA的干扰效果

3 讨论

第三章 PRRSV及其nsp1、nsp11对RNA诱导的基因沉默的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 PRRSV抑制shRNA、dsRNA、mi-RNA诱导的RNA沉默

2．2 PRRSV的nsp1 α和nsp11是RNA沉默的抑制子

3 讨论

第四章 nsp1 α木瓜蛋白酶和nsp11核酸内切酶失活后对RNA诱导的基因沉默的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 nsp1 α的木瓜蛋白酶的活性是它作为RNA沉默抑制子所必需的

2．2 nsp11的核酸内切酶的活性是它作为RNA沉默抑制子所必需的

3 讨论

第五部分 全文总结

参考文献