靶向PRRSV及其PAM细胞病毒受体基因shRNA重组腺病毒的构建与抑制PRRSV复制研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）为有囊膜的单链正股RNA病毒，属于尼多病毒目动脉炎病毒科，主要引起母猪早产、流产等繁殖障碍，仔猪、育肥猪呼吸困难及育成猪类流感疾病，并可持续性感染，引起免疫抑制，已经成为危害世界养猪业安全的重要病原之一。
　　 RNA干扰（RNAi）是由小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）引发的信使RNA（mRNA）序列特异性消减现象，在真核生物细胞具有基因表达调控的作用，同时又是一种保守的抗病毒机制.siRNA是19-27nt的小分子双链RNA片段，可以由体外转录或载体DNA转录的发夹RNA(short hairpin RNAs,shRNAs)得到。siRNA可以抑制同源的内源或病原mRNA的表达。本实验室利用pSUPER质粒介导PRRSV特异性shRNA可以有效抑制病毒在MARC-145中的复制增殖.
　　 本研究构建了表达靶向PRRSV不同基因和不同病毒受体基因shRNA的表达质粒及重组腺病毒，并在体外和体内对表达的shRNA抑制病毒复制和目的基因表达的效果进行了评价。本研究内容分为以下6个部分：
　　 1.PRRSV基因SYBR Green real-time PCR检测方法的建立
　　 针对PRRSV S1株和SY0608株的ORF1b基因设计了real-time PCR引物，通过优化反应条件，建立了real-time PCR检测ORF1b基因表达水平的方法。结果表明，建立的real-time PCR方法具有很好的敏感性、特异性和重复性，对PRRSV细胞培养物的检测下限为10～100TCID50。
　　 2.靶向ORF1b shRNA重组质粒在MARC-145细胞对PRRSV复制的抑制作用
　　 将靶向PRRSV ORF1b shRNA的重组质粒pSUPER-P2和pSUPER-P3分别转染MARC-145细胞，24h后再感染相同剂量PRRSV，感染PRRSV48h或72h.采用TCID50,real-time PCR和IFA方法分别检测shRNA重组质粒对PRRSV复制的抑制效果，探明抑制机制。结果为，MARC-145细胞转染pSUPER-P2或 pSUPER-P3后，接种PRRSV细胞病变(CPE)明显减轻，病毒TCID50滴度比PRRSV对照组细胞中的病毒量降低了约100倍；PRRSV ORF1b mRNA和ORF1b蛋白水平比对照明显降低(p＜o.05)。证明靶向ORF1基因的shRNA表达质粒能够在MARC-145细胞中有效抑制PRRSV的复制。
　　 3.靶向PRRSV不同基因的shRNA重组腺病毒的构建与鉴定
　　 将重组pSUPER（pSUPER-N3，pSUPER-G1,pSUPER-P2和pSUPER-P3）质粒中的PH1-shRNA表达框经PCR扩增后，隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMVPCMV启动子下游，重组穿梭载体测序鉴定后，与腺病毒骨架载体共转化BJ5183感受态细胞，获得shRNA腺病毒重组载体。再将重组腺病毒载体经PacI线性化后转染HEK-293A细胞，获得表达针对PRRSV不同阅读框shRNA的重组腺病毒rAd-N3(ORF7),rAd-G1(ORF5),rAd-P2( ORF1b)和rAd-P3(ORF1b)。同时构建了表达突变shRNA的重组腺病毒rAd-mN3和rAd-mP2，作为腺病毒对照，重组腺病毒接种HEK-293A细胞后72h出现CPE，荧光显微镜检查有GFP。重组病毒滴度均为10i0～1011efu/mL。PCR检测重组腺病毒基因组内PH1-shRNA表达框均为阳性。
　　 4.靶向PRRSV不同基因的shRNA重组腺病毒在体外抑制PRRSV复制的效果的比较
　　 为验证上述构建的表达shRNA的重组腺病毒(rAd-shRNA)是否能够有效抑制PRRSV的复制，在MARC-145细胞上先别接种500MOI的rAd-shRNA,24小时后感染10MOI的PRRSV S1株；感染PRRSV48小时后，观察PRRSV引起的CPE程度，并测定PRRSV的滴度；利用PRRSVN蛋白和ORF1b蛋白单克隆抗体及GP5蛋白多抗，采用间接免疫荧光(IFA)的方法检测蛋白含量，用real-time PCR的方法检测与shRNA对应的基因水平。结果表明：(1)shRNA重组腺病毒组CPE明显减轻，TCID50滴度明显低于rAd-mN3对照组(p＜0.05)i(2)与对照组相比PRRSV ORF7和ORF1b基因均被其特异性的shRNA抑制了至少100倍：(3)PRRSVN蛋白，GP5蛋白以及ORF1b蛋白的表达量与接种rAd-mN3及只感染PRRSV的对照组相比显著下降。该结果证明本研究构建的rAd-shRNA可以有效抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制。
　　 为了进一步研究rAd-shRNA是否能在PAM原代细胞中抑制PRRSV复制，在PAM细胞上，按照上述方法接种同样剂量的rAd-shRNA和PRRSV，感染PRRSV48小时，先观察CPE，用N蛋白单抗检测病毒含量的同时采用real-timePCR的方法分别检测细胞中N蛋白基因的水平，并测定病毒滴度。结果证明：(1)与对照组比，4个靶向PRRSV不同基因shRNA的重组腺病毒，均可以在PAM中有效抑制PRRSVS1株的复制，抑制效力为100～1000倍左右；(2)shRNAs对PRRSV的复制抑制作用随着时间的延长而逐渐减弱；(3)shRNAs对PRRSV的复制抑制作用具有明显的剂量依赖性，即抑制效力随着rAd-shRNA接种剂量的增加而增强；(4)PAM感染PRRSV后再接种rAd-shRNA或同时感染两种病毒时，rAd-N3、rAd-G1、rAd-P2和rAd-P3仍然能够有效地抑制病毒复制.
　　 5.靶向PRRSV ORF1b的shRNA重组腺病毒在体内外抑制高致病性PRRSV复制抑制效果研究
　　 选取靶向PRRSV ORF1b的2个重组腺病毒，按上述同样方法在MARC-145细胞上观察其抑制PRRSV传统毒株S1和高致病性毒株SY0608复制效果.结果表明，与表达突变shRNA的rAd-mP2对照组以及PRRSV接毒对照组相比，rAd-P2对S1株和SY0608株的复制均具有明显的抑制作用：而rAd-P3只能有效抑制S1株复制，对SY0608株的抑制作用不明显.
　　 选取PRRSV阴性猪，制备PAM细胞，用上述同样方法进一步观察rAd-P2抑制SY0608株复制效果.结果显示，rAd-P2可以有效抑制PRRSV细胞病变的产生；与对照相比，PRRSV N蛋白以及细胞内ORF1b mRNA水平均明显降低(p＜0.05)，且该抑制作用具有剂量依赖性，并随时间的延长逐渐减弱.
　　 选取20头6周龄PRRSV阴性仔猪，分成4组，每组5头.第1和2组分别肌肉注射rAd-P2和rAd-mP2，4×109TCID50/头，24小时后第1～3组分别肌肉注射PRRSV SY0608株（2×104.0 TCID50/头），第4组作为正常对照：接种后隔离饲养观察，每日测量体温和采血。接种PRRSV后第9天，将所有猪只宰杀，进行病理学观察和PRRSV real-time PCR检测。结果为，(1)临床症状：rAd-mP2组和攻毒对照动物，攻毒后第3天起出现体温升高（40.0～42℃），并出现食欲不振，嗜睡，呼吸困难，皮肤发红，眼睑水肿，轻微腹泻和背毛杂乱等临床症状，而rAd-P2组的动物攻毒后第6天才出现体温升高，症状轻于对照组(40.0～41℃)，在攻毒后第8天，3头动物出现轻微的临床症状：(2)病理学观察：rAd-P2组动物的肺部病变明显轻于对照组动物，其中只有3头猪的肺有轻微的间质性肺炎，其余两头猪肺外观无明显病理损伤。肺组织病理切片观察显示，rAd-mP2组和攻毒对照组动物的肺组织出现明显的间质性肺炎，如肺泡壁增厚，单核巨噬淋巴细胞浸润和支气管渗出物增多，而rAd-P2组仅3头动物肺组织出现了轻微的微观病理损伤；(3)病毒血症：对攻毒后第1天和第5天的血清中病毒含量检测，结果显示，攻毒后第5天时rAd-P2组动物的病毒血症与对照组相比，被明显抑制(p＜0.05)；(4)肺组织中PRRSV检测：rAd-P2组动物肺组织中病毒的平均含量同样明显低于对照组(p＜0.05)。
　　 6.表达靶向PRRSV受体基因shRNA重组质粒和重组腺病毒的构建与鉴定
　　 根据CD151、CD163和CD169（唾液酸黏附素）的基因序列分别设计引物，将扩增的基因片断克隆于pEGFP-N1载体，获得3个EGFP融合表达质粒。并以CD151、CD163和CD169基因为靶基因，设计合成具有小发夹结构的寡核酸序列，经退火成互补双链后，克隆于pSUPER质粒中；利用PCR技术扩增PH1-shRNA表达框，再克隆入重组腺病毒载体，获得表达shRNA的重组腺病毒rAd-151-1和rAd-151-2，rAd-163-1和rAd-163-2、rAd-169-1和rAd-169-2。将shRNA重组质粒与构建的融合表达质粒两两共转染HEK-293A细胞，分别在转染后72小时观察荧光表达情况。结果shRNA质粒共转染细胞中的荧光表达与对照细胞相比均有不同程度的减弱，或表达荧光细胞数的减少。

目录

文摘

英文文摘

第一章 猪繁殖与呼吸综合症病毒研究进展

1 PRRSV的生物学特性

2．病毒基因及编码蛋白

3 PRRSV细胞受体

4 病毒致病机制

5 PRRS疫苗

6 PRRSV防制存在的问题

参考文献

第二章 RNA干扰技术研究进展

1 RNAi定义与作用机理

2 siRNA靶序列的选择及其制备

3 介导RNAi的病毒载体

4 影响RNAi基因沉默动力学的因素

5 抗病毒研究应用

6 RNAi技术发展趋势

参考文献

第三章 PRRSV ORF1b基因水平SYBR Green实时RT-PCR检测方法的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

ESTABLISHMENT OF SYBR GREEN REAL-TIME PCR METHODS FOR PRRSV ORF1B GENE DETECTION

第四章 ORF1b shRNA重组质粒在MARC-145细胞中对PRRSV复制的抑制作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

INHIBITION OF REPLICATION OF PRRSV INDUCED BY ORF1B shRNA RECOMBINANT PLASMIDS IN MARC-145

第五章 靶向PRRSV ORF1b、ORF5和ORF7 shRNA重组腺病毒的构建

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

CONSTRUCTION OF shRNA RECOMBINANT ADENOVIRUSES TARGETING TO PRRSV ORF1B、ORF5 AND ORF7 GENES

第六章 靶向PRRSV不同基因shRNA重组腺病毒体外抑制PRRSV S1复制效果的比较

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

COMPARESON OF SUPPRESSION OF PRRSV S1 REPLICATION INDUCED BY shRNA RECOMBINANT ADENOVIRUSES TARGETING DIFFERENT PRRSV GENES IN VITRO

第七章 shRNA重组腺病毒体内外抑制高致病性PRRSV复制研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

INHIBITION OF HIGH PATHOGENIC PRRSV REPLICATION INDUCED BY shRNA EXPRESSING RECOMBINANT ADENOVIRUS BOTH IN VITRO AND IN VIVO

第八章 靶向PRRSV不同受体基因shRNA重组质粒和腺病毒载体的构建与鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

CONSTRUCTION AND IDENTIFICATION OF shRNA RECOMBINANT PLASMIDS AND ADENOVIRUSES TARGETING TO PRRSV DIFFERENT RECEPTOR GENES

全文总结

致谢

攻读学位期间发表的论文