猪δ冠状病毒E和S1蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

摘要

猪δ冠状病毒（Porcine Deltacoronaviruses,PDCoV）属于冠状病毒科δ冠状病毒属，2012年在香港的猪群中检测到该病毒，并于2014年在美国爆发后在全世界范围传播。目前还没有可用于猪δ冠状病毒诊断和预防的商用试剂或疫苗，因此对猪δ冠状病毒疫苗和诊断方法的研究是非常重要的。猪δ冠状病毒E蛋白和S蛋白是该病毒的重要结构蛋白，在病毒成熟过程中S蛋白被蛋白酶切割成S1和S2，S2区域比较保守，抗原位点和变异区主要在S1区域；E蛋白是小包膜蛋白，对于猪δ冠状病毒在宿主的组装和侵染有重要作用。本研究将猪δ冠状病毒HKU15-44株E蛋白和S1蛋白作为抗原分别免疫新西兰兔，并对兔子产生的抗体效价进行测定。研究结果如下：
　　1猪δ冠状病毒E蛋白载体构建与表达
　　本研究合成的质粒pET21b-pSUMO-CoVE所表达的目的蛋白可溶性部分占比87％，可溶性良好但目的蛋白不便于纯化。利用PCR的方法将6×His标签与pET21b-pSUMO-CoVE质粒重组构建pET21b-6×His-pSUMO-CoVE重组质粒，转化至大肠杆菌BL21（DE3）。诱导表达后经SDS-PAGE检测，结果表明成功构建了pET21b-6×His-pSUMO-CoVE重组质粒，并表达和纯化出His-CoVE目的蛋白，该蛋白分子量为56KD，为研究猪δ冠状病毒E蛋白的免疫作用提供基础。
　　2猪δ冠状病毒S1蛋白载体构建与表达
　　本研究合成了pET21b-pSUMO-CoVS1质粒，经过SDS-PAGE电泳检测和灰度分析，p ET21b-pSUMO-CoVS1所表达的目的蛋白可溶部分占比34%。为了促进目的蛋白的可溶性，利用载体重组的方法将CoVS1基因与八个可溶性标签相连构建了八个重组质粒：pET21b-6×His-Grifin-CoVS1、pET21b-6×His-GST-CoVS1、pET21b-6×His-MBP-CoVS1、pET21b-6×Hi s-SUMO-CoVS1、pET21b-6×His-Thioredoxin-CoVS1、pET21b-6×His-γ-crystallin-CoVS1、pE T21b-6×His-ArsC-CoVS1、pET21b-6×His-PpiB-CoVS1。酶切鉴定结果表明成功构建了八个重组质粒，经过SDS-PAGE电泳检测和灰度分析，pET21b-6×His-MBP-CoVS1融合表达效果最好，目的蛋白可溶部分占比62%，与pET21b-pSUMO-CoVS1质粒相比融合蛋白可溶性提高1.8倍，并且成功纯化出MBP-CoVS1重组蛋白，MBP-CoVS1重组蛋白可用于下一步免疫试验。
　　3猪δ冠状病毒E蛋白和S1蛋白免疫效果研究
　　His-CoVE和MBP-CoVS1重组蛋白分别经过诱导表达和纯化后，与弗氏佐剂等体积混匀制备疫苗，每只1mg重组蛋白免疫新西兰兔。四免后一周采血分离血清，以Western-blot和ELISA方法检测免疫效果，以His-CoVE和MBP-CoVS1重组蛋白为抗原，分离的血清作为一抗，Western-blot结果表明His-CoVE和MBP-CoVS1在相应位置均有阳性条带；以猪δ冠状病毒CH-01包被抗原，分离的血清作为一抗，ELISA检测MBP-CoVS1组免疫后血清效价达到1:6400，His-CoVE组免疫后血清效价达到1:3200，均显著的高于对照组。本研究分离的血清可作为多克隆抗体用于PDCoV的诊断研究与中和试验，为PDCoV的诊断与预防提供理论基础和参考。

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1文献综述

1.1冠状病毒

1.2 猪δ冠状病毒

1.2.1 猪δ冠状病毒发现与流行状况

1.2.2 猪δ冠状病毒基因组特征

1.2.3 猪δ冠状病毒感染临床症状

1.2.4 猪δ冠状病毒的诊断方法

1.3 冠状病毒结构蛋白

1.3.1 Spike刺突糖蛋白

1.3.2 M蛋白

1.3.3 E蛋白

1.3.4 N蛋白

1.4 大肠杆菌表达系统及融合标签

1.4.1多聚组氨酸标签

1.4.2 Grifin标签

1.4.3 GST标签

1.4.4 MBP标签

1.4.5 SUMO标签

1.4.6 Thioredoxin标签

1.4.7γ-crystallin标签

1.4.8 ArsC标签

1.4.9 PpiB标签

2 引言

3 材料与方法

3.1材料

3.1.1质粒和菌株

3.1.2主要仪器设备

3.1.3试剂

3.2 冠状病毒E蛋白的载体构建与表达

3.2.1 合成目的基因

3.2.2 PDCoV的E蛋白可溶性鉴定

3.2.3 构建冠状病毒E蛋白载体

3.2.4冠状病毒E蛋白的表达与纯化

3.3 冠状病毒S1蛋白的载体构建与表达

3.3.1 合成目的基因

3.3.2 PDCoV的S1蛋白可溶性鉴定

3.3.3 构建冠状病毒S1蛋白的载体

3.3.4 冠状病毒S1蛋白的表达与纯化

3.4 冠状病毒E和S1蛋白免疫作用的研究

3.4.1 冠状病毒E和S1蛋白疫苗的制备

3.4.2 动物分组及免疫

3.4.3 冠状病毒E和S1蛋白免疫效果

3.4.4 免疫血清抗体效价检测

4 结果与分析

4.1 冠状病毒E蛋白的载体构建与表达鉴定

4.1.1 冠状病毒E可溶性鉴定

4.1.2 冠状病毒E蛋白载体构建

4.1.3 E蛋白的表达与纯化结果

4.2 冠状病毒S1蛋白的载体构建与表达鉴定

4.2.1 冠状病毒S1蛋白可溶性鉴定

4.2.2 冠状病毒S1蛋白的载体构建

4.2.3冠状病毒S1蛋白的表达与纯化结果

4.3 冠状病毒E和S1蛋白免疫作用的研究

4.3.1 冠状病毒E和S1蛋白免疫效果

4.3.2 免疫血清抗体效价检测

5 结论与讨论

5.1 讨论

5.2 结论

参考文献

英文摘要