利用CRISPR/Cas9技术制备MSTN基因敲除绵羊

摘要

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生长发育的负调控因子，该基因突变使个体表现为“双肌”表型。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除绵羊MSTN基因，成功制备基因编辑绵羊，为未来的绵羊种质创新提供了素材。
　　(1)CRISPR/Cas9-MSTN-gRNA的设计及活性验证:从绵羊MSTN基因CDS筛选出10个靶向位点，对其中4个靶向位点构建Cas9/gRNA，并在体外环境验证活性后得到最高体外切割效率(55％)的MSTN-gRNA-1靶向位点。
　　(2)精子来源对卵母细胞体外受精效果的影响:附睾鲜精和冻精卵裂率分别为85.03％、7125％，附睾鲜精卵裂率显著高于冻精(P＜0.05)。附睾鲜精和冻精桑囊率分别为4874％、3176％，附睾鲜精显著高于冻精(P＜0.05)。结果表明，绵羊体外受精受精子类型影响较大，采用附睾鲜精可获得理想卵裂率和桑囊率。
　　(3)精卵共培养时间(18h、221h、24h、26h)对卵母细胞体外受精效果的影响，精卵共培养18h、22h、24h、26h卵裂率分别为55.13％、83.06％、81.09％、7391％，22小时与18h差异性极显著(P＜0.01)，与26h差异性显著(P＜005)，与24h差异性不显著(P＞05)。精卵共培养18h、22h、24h、26h桑囊率分别为27.91％、4466％、35.33％、2823％，22小时与18h、24h、26h均差异性显著（P＜0.05）。结果表明，22h卵母细胞体外受精较好。
　　(4)不同时间(9h、10h、11h、12h)注射外源RNA对胚胎发育的影响:9h、10h、11h、12h的卵裂率分别为42.95％、32.26％、20％、13.56％，9h与11h、12h差异性极显著(P＜001)，与10h差异性显著（P＜0.05）。9h、10h、11h、12h的桑囊率分别为37.50％、14.44％、087％、12.5％，9h与10h、11h、12h均差异性极显著（P＜0.01）。结果表明，精卵共培养9h进行1细胞受精卵注射较好。
　　(5)注射不同浓度的外源RNA对胚胎发育的影响:浓度①(Cas9:50ng/ul，gRNA.25ng/uL)、②(Cas9:25ng/uL，gRNA:12.5ng/uL)、③(Cas9.12.5ng/uL，gRNA:6.25ng/uL)的的卵裂率分别为41.67％、57.25％、59.09％，②与①差异性显著(P＜0.05)，与③相比卵裂率降低，但差异性不显著(P＞005)。①、②、③的桑囊率分别为20％、3797％、38.46％，②与①差异性极显著(P＜001)，与③相比，桑囊率有所下降，但差异性不显著(P＞0.05)。结果表明，为达到卵裂率及桑囊率高的效果，③浓度较好。
　　(6)绵羊胚胎中gRNA-Cas9切割效率验证:采用注射浓度Cas9:12.5ng/uL，gRNA6.25ng/uL时，gRNA-Cas9mix(mRNAmix)对绵羊胚胎MSTN基因切割效率为23.5％。
　　(7)注射后的胚胎发育到囊胚后，经胚胎移植后与2016年10月得到敲除MSTN基因的绵羊。

目录

声明

致谢

缩略语

摘要

1 文献综述

1．1 MSTN

1．1．1 MSTN基因起源

1．1．2 MSTN基因结构

1．1．3 MSTN基因的表达

1．2．3 CRISPR的作用机理

1．2．4 CRISPR／Cas的应用

1．3 体外受精技术

1．3．1 体外受精技术研究历史

1．3．2 影响体外受精技术的因素

1．3．3 体外受精技术的应用前景

1．4 显微注射法

1．4．1 影响显微注射对转基因胚胎基因敲除效率的因素

2 引言

3 CRISPR／Cas9-MSTN-gRNA的设计及活性验证

3．1 MSTN-gRNA靶向位点的选取

3．2 MSTN-gRNA靶向位点的合成

3．3 gRNA体外活性检测

3．3．1 实验材料

3．3．2 实验步骤

3．4 Cas9／gRNA体外酶切反应

3．5 Cas9／gRNA体外一切结果

3．6 讨论

4 绵羊卵母细胞体外受精及显微注射

4．1．2 主要试剂

4．1．3 仪器与设备

4．1．4 主要溶液

4．2 实验步骤

4．2．1 卵巢的清洗

4．2．2 卵母细胞的采集

4．2．3 卵母细胞的分级

4．2．7 精子处理

4．2．8 成熟卵母细胞的体外受精

4．3 数据分析

4．4 实验设计

4．4．1 精子类型对绵羊体外受精效果的影响

4．4．2 精卵共培养时间对绵羊体外受精效果的影响

4．5 结果与分析

4．5．1 精子来源对卵母细胞体外受精效果的影响

4．5．1 精卵共培养时间对卵母细胞体外受精效果的影响

4．6 讨论

4．6．1 精子来源对卵母细胞体外受精效果的影响

4．6．1 精卵共培养时间对卵母细胞体外受精效果的影响

5 绵羊IVF受精卵mRNAmix显微注射

5．1 材料

5．1 实验步骤

5．1．1 注射前卵母细胞处理

5．1．2 显微操作针制作前的玻璃管处理

5．1．3 拉针

5．1．4 制作注射针

5．1．5 持卵针的制作

5．1．6 操作盘的准备

5．1．7 受精卵的准备

5．2 胞质显微注射

5．3 胞质注射后受精卵的体外培养

5．4 实验设计

5．6．1 不同时间注射外源RNA对胚胎发育的影响

5．6．2 注射不同浓度的外源RNA对胚胎发育的影响

5．7 讨论

5．7．1 不同时间注射外源RNA对胚胎发育的影响

5．7．2 注射不同浓度的外源RNA对胚胎发育的影响

6 绵羊胚胎中gRNA-Cas9切割效率验证

6．1 材料和试剂

6．1．1 实验材料

6．1．2 实验试剂

6．1．3 实验仪器

6．2 实验步骤

6．3 实验结果

6．4 讨论

7 绵羊胚胎移植、B超检测及接生

7．1 材料和试剂

7．1．1 实验材料

7．2．4 手术过程

7．3 术后管理

7．6 新生羔羊的护理

8 基因编辑阳性个体的验证

8．3 实验结果

8．3．2 测序结果

8．4 讨论

8 结论

参考文献

附图