CRISPR/Cas9介导MSTN基因敲除绵羊制备

摘要

肌肉性状是动物的重要经济性状之一，肌肉生长过程受遗传和环境双重因素影响，研究表明肌肉的发生和发育过程涉及到诸多基因的调控作用，其中肌肉生成抑制素(Myostatin，MSTN)基因被认为是与动物酮体重和瘦肉率有关的主要基因。MSTN基因，又名GDF-8(growth differentiation factor8)，属于TGF-β（transforming growth factorβ，转化生长因子β）超家族GDF亚族，高度表达于动物机体骨骼肌中，是负向调控肌肉生长的重要基因，许多科学研究都表明该基因表达水平与肌肉重量的变化呈负相关，或突变可以造成肌肉过度肥大。本研究利用CRISPR/Cas9技术敲除MSTN基因，验证其对于肌细胞分化的影响作用，并利用单克隆细胞系筛选和体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术制备MSTN基因缺失表达的转基因绵羊个体，研究结果为改善绵羊肌肉品质和经济效益提供参考价值，对于培育新型肉用绵羊品种和丰富生物多样性也具有理论和实践意义。主要研究内容和结果如下:
　　1.MSTN基因敲除载体构建及活性验证:以绵羊肌肉组织总RNA反转录获得的cDNA为模板，PCR体外扩增绵羊MSTN基因CDS序列，产物纯化后送公司测序分析;设计在全基因组内无同源性的靶位点gRNA，体外搭桥PCR构建包含gRNA酶切DNA，以已知SSA活性的标准gRNA为对照，Cas9酶切反应检测luciferase信号;构建高体外活性的sMSTN-Cas9/gRNA敲除载体，以FuGene HD脂质体按1∶3的比例转染自1周龄小羊耳组织真皮层分离的SEFs（sheep ear fabroblasts，绵羊耳成纤维细胞），阳性细胞收集并提取基因组DNA，克隆出靶点前后1000bp左右片段，T7E1酶切检测靶点活性。测序结果显示MSTN基因克隆成功，与绵羊同源性为100％;体外活性共验证4个gRNA靶点，酶切活性分别50％、65％、5％、95％;选取最高的gRNA4靶点进行内源活性验证，结果表明突变型基因组成功被T7E1酶剪切出相应大小的条带，显示该靶点具有兼具外源和内源活性，符合后期实验要求。
　　2.MSTN基因敲除影响SMSCs成肌分化的研究:采用两酶消化法分离sSMSC(SheepSkeletal muscle Satellite Cell，sSMSC)，采集刚出生小羊骨骼肌，经肌膜剥除、肌丝消化和差速贴壁纯化等步骤，在F5代获得了较高纯度的sSMSCs。间接免疫荧光检测sSMSCs标记基因Pax-7并统计阳性细胞，结果为89.3％士2.8％的细胞为Pax-7阳性细胞，表明sSMSCs纯度较高;1％低血请浓度饥饿诱导sSMSCs显示在72h可以得到大量分化早期的肌管细胞。将MSTN-Cas9/gRNA4载体转染sSMSCs，puro连续筛选后饥饿诱导72h，间接免疫荧光检测成肌分化早期标志Desmin蛋白，结果显示:1％低浓度血清饥饿诱导处理72h，对照组和敲除组肌管形成效率分别为11.2±1.3％、19.5±2.1％，肌管平均长度为22±3.4μm、47±2.8μm，显示MSTN基因敲除可以在数量和长度上促进卫星细胞成肌分化。
　　3.无标记敲除MSTN基因单克隆细胞系制备:为了符合转基因动物生产规范和要求，对现有载体进行改造，利用限制性内切酶MLuⅠ和SpeⅠ进行双酶切反应切除包含标记基因GFP和puro片段，获得无标记质粒。以200V电压转染SEFs后利用细玻璃针和口吸管装置，接种单个细胞至96孔板每小孔中使其贴壁生长并扩大成细胞系。以各单细胞系基因组DNA为模板，PCR克隆靶点上下游片段，送公司测序。实验接种4个96孔，一共观察到107个小孔内有细胞存在，其中93孔为单细胞，最终成功增殖的细胞系共61株;测序结果经UCSC序列比对共得到3个突变型细胞系，突变率约为9.3％;其中18号细胞株靶点序列21bp正向缺失，15号细胞株发生29个碱基错配，16号细胞株在靶点前11bp往后序列全部错配。
　　4.SCNT法制备转基因克隆绵羊:选择突变碱基较多的16号为核移植供体细胞，体外分离绵羊卵母细胞并成熟19-22h，挑选排第一极体的成熟卵母细胞为受体细胞。显微镜下去除受体细胞核并将供体细胞注入受体细胞膜与透明带之间，电击使两者融合，融合胚胎经孤雌激活和体外发育后，选择均匀卵裂的胚胎手术移植入发情母羊排卵侧卵巢连接的输卵管内。手术后3个月，利用B超检测母羊妊娠情况。本次实验中，绵羊卵母细胞体外成熟率、供受体融合率以及卵裂率平均值分别为66.0％、69.5％、80.9％，均达到了国内平均水平;核移植手术共移植415枚胚胎至20只母羊输卵管内;B超检测结果显示，其中8只母羊确认怀孕，妊娠率为40％。

目录

摘要

符号表(缩略语表)

主要仪器

第一章 文献综述

1 基因靶向编辑技术

1．1 ZFN技术

1．2 TALEN技术

1．3 CRISPR／Cas9技术

1．4 NgAgo-gDNA编辑技术

2 MSTN基因

2．1 MSTN基因的研究进展

2．2 MSTN基因与生长性状的相关性研究

2．3 MSTN基因信号传导机制

3 转基因动物生产技术

3．1 显微注射法

3．2 逆转录病毒感染法

3．3 胚胎干细胞介导法

3．4 精子导入法

3．5 体细胞核移植技术

4 研究目的与意义

参考文献

第二章 MSTN基因敲除载体构建及活性验证

材料和试剂

1．1 实验材料

1．2 实验试剂

1．3 引物信息

方法和步骤

2．1 绵羊耳成纤维细胞(Sheep Ear Fibroblasts，SEFs)体外培养

2．2 CRISPR／Cas9-MSTN-gRNA敲除质粒构建

2．3 敲除载体活性验证

3．实验结果

3．1 SEFs的分离培养

3．2 CRISPR／Cas9-MSTN-gRNA敲除质粒构建

3．3 敲除载体活性验证

4 讨论

5 结论

参考文献

第三章 MSTN基因敲除影响骨骼肌卫星细胞成肌分化的研究

实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验试剂

1．3 引物信息

2 方法与步骤

2．1 sSMSCs体外分离培养鉴定与诱导

2．2 puro对sSMSCs最小致死量的测定

2．3 MSTN基因的敲除表达及其对成肌分化的作用

3 实验结果

3．1 sSMSCs体外分离培养与鉴定

3．2 饥饿诱导sSMSCs分化形成肌管细胞

3．3 puro对sSMSCs的最小致死量

3．4 MSTN基因敲除对sSMSCs成肌分化的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

第四章 无标记敲除MSTN基因绵羊成纤维细胞系建立

1 材料与试剂

1．1 实验材料

1．2 实验试剂

1．3 实验耗材

1．4 PCR引物和反应程序

2 方法与步骤

2．1 MSTN基因无标记敲除载体构建

2．2 MSTN敲除载体DNA电转染SEFs最佳条件确定

2．3 单克隆细胞系制备

2．4 MSTN基因敲除阳性细胞系的鉴定

3 结果

3．1 无标记MSTN敲除载体的获得

3．2 敲除载体电击法转染SEFs最佳条件检测

3．3 单克隆细胞系的制备

3．4 MSTN基因敲除阳性单细胞系的鉴定

4 讨论

5 结论

参考文献

第五章 体细胞核移植制备转基因羊

1 材料与试剂

1．1 实验材料

1．3 实验试剂

2 方法与步骤

2．1 供体细胞准备

2．2 受体细胞准备

2．3 体细胞核移植

2．4 重组胚胎孤雌激活和体外发育

2．5 胚胎移植

3 实验结果

3．1 绵羊卵母细胞体外成熟

3．2 体细胞核移植以及重构胚胎发育

3．3 胚胎移植及妊娠检测

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

声明