河南省PRV血清学调查及鉴别野毒/疫苗毒株二重FQ-PCR方法的建立

摘要

为了更好的了解河南省猪伪狂犬的流行状况，本次调查通过对本实验室2007-2014年以来血清学数据进行汇总，按照不同时间、不同地区、不同生长阶段猪群划分，从时间、空间、畜间三个角度全面分析近几年河南省PR的流行趋势。
　　比较分析得出：2007年-2010年河南省猪伪狂犬 gE抗体阳性率呈逐年下降趋势，但在2010年以后河南省猪伪狂犬gE抗体阳性率持续升高；将2014年检测1373头猪血清抗体数据，按照区域划分为豫东、豫西、豫北、豫南、豫中5个地区，结果显示豫北地区 PRV野毒感染率高达66.67％，其次是豫中和豫南地区分别59.51%、53.9%；将2014年766头背景清晰的血清学数据，按照猪不同饲养阶段进行分群，得出母猪和后备母猪的阳性率分别高达64.21、50%，其次是育肥猪野毒的阳性率为49.01%。
　　虽然疫苗的免疫接种是预防和控制猪伪狂犬病的根本措施，但近几年 PR仍呈高爆发趋势，因此如何鉴别野毒和疫苗毒株感染成为了一个重要的问题。本研究根据 GenBank中PRV-gD/gE基因序列，选取高度保守序列设计2对特异性引物和2条 MGB探针。采用矩阵法筛选最佳引物和探针浓度，优化最佳退火温度。分别对该方法进行灵敏度、敏感性、特异性、重复性和稳定性试验，并对疑似PRV感染的疑似样品进行临床应用性试验，同常规PCR方法进行了对比。
　　结果显示，经过优化后的最佳引物浓度组合PRV-gE/p1、PRV-gD/p1/p2均为0.7μmol/L，PRV-gE/p2为0.8μmol/L；探针分别为 Probe-PRV-gE为0.4μmol/L、Probe-PRV-gD为1.4μmol/L；最佳退火温度为60℃。pGEM-T/PRV-gE最低检出限均为1×101拷贝/μL，灵敏度为常规PCR的10倍；pGEM-T/PRV-gD最低检出限为1×102，灵敏度为常规 PCR相同。对9种病毒和3种疫苗进行特异试验，结果表明该方法具有良好的特异性，而且可以对野毒株和疫苗毒株进行鉴别。将pGEM-T/PRV-gE和 pGEM-T/PRV-gD质粒等体积混合均匀，对1×107、1×105、1×102拷贝/μL分别进行3次重复，表明该方法具有较好的重复性；对以55份临床疑似阳性样品分别进行二重 FQ-PCR和常规 PCR检测，二重 FQ-PCR检出阳性样品30份，其中双阳性基因19份，gD阳性11份，常规PCR检出阳性样品25份，其中双阳性15份，gD阳性10份。结果显示，二重FQ-PCR比常规PCR方法阳性样品检出率高比常规 PCR更灵敏。成功建立了鉴别猪伪狂犬病野毒株与疫苗毒株的二重 FQ-PCR的方法。通过检测 gD扩增结果阳性，gE扩增结果阴性，则判定为PR疫苗毒株感染；gD扩增曲线为阳性，同时gE也为阳性的则判定为PR野毒感染。
　　本方法的建立，不仅可以用于PRV早期病毒感染诊断，而且同时能够鉴别野毒株/疫苗毒株感染，对PRV的防制和净化具有重要意义。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 病毒的基本特征

1.1.1 病原特点

1.1.2 结构蛋白与功能

1.2 流行特点

1.2.1 传染源

1.2.2 易感动物

1.2.3 传播途径

1.2.4 流行现状

1.3 诊断方法

1.3.1 病原分离鉴定

1.3.2 动物接种

1.3.3 血清学方法

1.3.4 分子生物学方法

1.4 防控现状

1.4.1 加强日常管理

1.4.2 减少应激因素

1.4.3 制定合理的免疫程序，使用高质量疫苗

1.4.4 猪群的净化

第2章 河南省猪伪狂犬病血清学调查

2.1 数据来源及调查方法

2.1.1 数据来源

2.1.2 调查方法

2.2 结果

2.2.1 不同年份猪伪狂犬gE抗体阳性率

2.2.2 不同地区猪场伪狂犬gE抗体阳性率

2.2.3 不同猪群伪狂犬gE抗体阳性率

2.3 讨论

2.3.1 2007-2014年河南省PRV流行趋势

2.3.22014年河南各地区PRV gE抗体阳性率

2.3.3 不同生长阶段猪群PRVgE抗体阳性率

第3章 鉴别猪伪狂犬野毒/疫苗株二重FQ-PCR方法的建立

3.1 材料

3.1.1 菌（毒）株及样品

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要设备

3.2 方法

3.2.1 引物和探针的设计与合成

3.2.2 PRV标准阳性模板的制备

3.2.3 反应条件的优化

3.2.4 灵敏度测定及标准曲线的建立

3.2.5 特异性试验

3.2.6 稳定性和重复性试验

3.2.7 临床应用试验

3.3 结果

3.3.1 PCR 扩增结果

3.3.2 菌液鉴定结果

3.3.3 质粒 DNA 浓度的测定

3.3.4 最佳反应体系和条件的确定

3.3.5 灵敏度测定及标准曲线的建立

3.3.6 特异性试验

3.3.7 稳定性和重复性试验

3.3.8 临床应用试验

3.4 讨论

第4章 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果