鉴别CSF和PR野毒与疫苗毒mPCR方法的建立及其净化的研究

摘要

猪瘟和猪伪狂犬病是猪的两种重要疫病，其中猪瘟属于我国一类动物疫病，伪狂犬病属于我国二类动物疫病，两种疫病在我国大型规模化猪场仍普遍存在，直接或间接地影响着我国养猪业的健康发展。近年来，随着猪瘟和伪狂犬病诊断技术和综合防控措施研究的不断突破与创新，以及猪瘟和猪伪狂犬病的净化技术的成熟，规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病的净化已被列入《国家中长期动物疫病防治规划》（2012-2020）。为进一步探索研究规模化猪场猪瘟和伪狂犬病的净化方案，本研究在利用猪伪狂犬病gE/gB--ELISA抗体检测鉴别伪狂犬病野毒和疫苗毒成熟技术的基础上，建立了猪瘟和猪伪狂犬病疫苗毒和野毒的多重PCR鉴别诊断方法，制定并实施了规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化方案，该研究可为规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病的净化提供技术参考。
　　1、鉴别猪瘟和猪伪狂犬野毒与疫苗毒的单一PCR检测方法的建立
　　通过对GenBank中猪瘟野毒与疫苗毒及近源病毒的基因组全序列对比分析，发现猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株3' NTR独立存在富含T的插入序列，根据这一特点分别在该插入序列的上下两端设计两对单一RT-PCR引物，并进行条件优化筛选，建立了能鉴别猪瘟野毒和疫苗毒的单一RT-PCR鉴别诊断方法；根据PRV疫苗大多缺失gE基因序列而设计针对该基因的引物，能鉴别PR的野毒感染。敏感性和特异性实验表明：CSFV单一RT-PCR检测中各引物最低核酸检测量分别为2.2pg（单一RT-PCR中的一对引物）和1.7pg（单一RT-PCR中的另外一对引物），两种方法均检测不到PRV、PRRSV、JEV、BVDV、PCV2的DNA/RNA；PRV单一PCR检测中，对贵州分离的野毒株检测出现阳性条带，而对CSFV、PRRSV、JEV和PCV2检测均无条带。采用该方法对146份临床可疑样品进行检测结果发现：CSF与PR野毒混合感染率在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中分别为6.3％(3/48)、7.4%(2/27)、8.3%(3/36)、8.6%(3/35)。本研究建立的单一PCR方法都具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点，该研究对规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬的净化具有一定的参考价值。
　　2、猪瘟二重RT-PCR和猪伪狂犬三重PCR鉴别诊断方法的建立
　　在针对CSFV野毒、CSFV-C疫苗株、PR Guizhou-DY株、Bartha-K61株和SA215株而建立的单项RT-PCR/PCR方法基础上，参照GenBank中CSFV shimen毒株、弱毒疫苗C株等18株基因序列和PRV闽A株等10株相关基因序列进行对比研究分析，并设计2对能鉴别猪瘟野毒和疫苗毒株的特异性多重引物，可区分CSF野毒感染和疫苗毒株；设计3对PRV特异性多重引物，可区分PR野毒感染和疫苗毒株。以阳性病毒核酸为模板进行多重PCR扩增及反应体系和反应条件的优化，建立了能同时检测CSF强弱毒的二重RT-PCR方法和能同时检测PRV野毒与疫苗毒的三重PCR方法。该方法对临床病料的检测结果与单项PCR结果一致，分别可检测到：CSFV野毒株和弱毒疫苗(C-株)最低检测量分别为10.4 pg和29.8 pg；PRV各株的最低检测量分别为 Guizhou-DY株8.6 pg、弱毒疫苗Bartha-K61株26.3 pg株及3基因缺失疫苗SA215株9.4 pg。
　　3、鉴别猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒野毒与疫苗毒株五重PCR方法的建立
　　本实验根据已建立的CSFV二重RT-PCR方法与PRV三重PCR方法，通过以这5对引物为基础，逐步优化反应条件，成功建立了能鉴别猪瘟和猪伪狂犬野毒与疫苗毒株的五重PCR方法，敏感性和特异性试验结果表明，构建的五重PCR最低核酸检测量分别为6.2 pg（CSF野毒株）、21.3 pg（CSFV-C株疫苗毒）、5.8 pg(PR Guizhou-DY)、20.8 pg(Bartha-K61)和8.6 pg(SA215)；对PCV2、PRRSV、JEV和BVDV扩增结果均为阴性。采用该方法对134份可疑临床样品进行检测结果发现：CSF和PR疫苗毒与野毒在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的五重检测率分别为2.6%(1/38)、7.7%(2/26)、8.3%(3/36)和8.8%(3/34)，实现了DNA病毒及RNA病毒的同步检测。该五重PCR方法的建立为从病原学方面快速鉴别CSF和PR疫苗毒与野毒提供了新的技术支撑，为规模化猪场实现猪瘟与猪伪狂犬的净化提供一种检测病原的新方法。
　　4、规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化方案及其应用的研究
　　本实验根据我国养猪业现状，从免疫、监测、防控及生物安全体系建设等方面制定规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病的防控措施及净化方案，应用该方案对贵州4个规模化猪场1118份不同阶段（能繁母猪、保育猪、育肥猪、哺乳仔猪）送检血样进行CSF ELISA抗体监测、PR gE和PR gB-ELISA抗体监测及扁桃体样进行猪瘟病原学PCR检测。首先对送检血样进行猪瘟血清学监测了解猪群猪瘟免疫后的抗体情况，再对扁桃体进行猪瘟PCR检测并淘汰阳性猪群；对于是否有猪伪狂犬病先采用gE-ELISA、gB-ELISA抗体检测后进行初级净化淘汰，再对猪瘟和（或）伪狂犬病野毒感染的可疑猪群用建立的mPCR方法进行辅助鉴别诊断；实验结果表明：在应用该净化方案对各规模化猪场进行初次净化检测后，通过淘汰阳性猪和加强免疫相结合，再次检测发现猪场猪瘟与伪狂犬病抗体保护水平均有升高，野毒感染率呈下降趋势。该净化方案的建立及初步应用为规模化猪场前期淘汰阳性猪群并为实现猪场猪瘟和猪伪狂犬病的净化提供了参考。