B.cereus MBL13-U胶原蛋白酶分离纯化及其降解牛骨胶原蛋白机理的研究

摘要

牛骨骼中的I型胶原蛋白含量丰富，但因得不到合理利用而造成巨大的浪费。因此，本研究采用前期从自然界筛选到高效降解牛骨胶原蛋白的蜡样芽孢杆菌B.cereus MBL13-U，通过发酵制备胶原蛋白粗酶，经过一系列分离纯化技术得到具有特异性降解牛骨I型胶原蛋白的酶（Collagenase for specific bovine-bone collagen degradation，CSCD），将CSCD酶用于降解牛骨胶原蛋白，构建降解过程的动力学模型，并对其降解牛骨胶原蛋白的机理进行了初步探讨，为牛骨骼的深加工利用奠定理论基础。
　　主要研究结果如下：
　　（1）B.cereus MBL13-U菌株发酵制备胶原蛋白酶的工艺优化。通过单因素试验研究了菌株接种量、反应温度、pH值、反应时间对胶原蛋白酶酶活的影响，在此基础上以胶原蛋白酶酶活为指标，通过四元二次正交旋转组合试验，确定了发酵制备胶原蛋白酶的最佳工艺参数为菌株接种量4 mL/100mL，反应温度35℃，pH值6.4，反应时间46 h，在此条件下胶原蛋白酶酶活达到92.31 U/mL。
　　（2）胶原蛋白酶的分离纯化及特性分析。将菌株B.cereus MBL13-U粗酶液依次通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100凝胶层析，得到CSCD酶，分子量约为52 kDa，纯化倍数达到42.85倍。通过对CSCD酶的酶学特性分析得出CSCD酶的最适温度为50℃，在低于50℃的中低温环境中热稳定性良好，但在相对高温的条件下稳定性较差；最适pH值为6.5，pH在5.5-7.5的条件下相对稳定，不适于强酸或碱性环境；CSCD酶能够特异性降解牛骨I型胶原蛋白，与其他蛋白酶相比，其对牛跟腱I型胶原蛋白的作用最为显著。
　　（3）CSCD酶降解牛骨胶原蛋白的工艺优化。通过单因素试验研究了反应温度、牛骨粗胶原蛋白添加量、CSCD酶添加量、反应时间、pH值对水解度的影响，在此基础上以水解度为指标，通过五元二次正交旋转组合试验，确定了CSCD酶降解牛骨胶原蛋白的最佳工艺参数为反应温度46℃，牛骨粗胶原蛋白添加量5.14 g/100mL，CSCD酶添加量0.42 g/100mL，反应时间6 h，pH值6.5，在此工艺条件下水解度为31.21％。
　　（4）CSCD酶降解牛骨胶原蛋白的动力学模型构建。通过CSCD酶添加量和牛骨粗胶原蛋白添加量对降解过程中水解度的影响，以米氏方程为基础，构建了蛋白降解过程的降解速率与水解度动力学模型，同时得出降解牛骨胶原蛋白过程中CSCD酶的失活常数K4为67.1157 h-1，试验值与模型拟合值基本吻合，模型有效可行。
　　（5）初步探讨CSCD酶对牛骨胶原蛋白的降解机理。采用游离氨基酸检测、紫外光谱，荧光光谱、差示量热扫描、红外光谱、扫描电镜对牛骨胶原蛋白和降解后的胶原蛋白肽进行结构表征，并对其机理进行了探讨，结果表明：CSCD酶的降解作用破坏了牛骨胶原蛋白的三股螺旋结构，使其表面暴露出更多的氨基酸残基，游离出大量的氨基酸；随着降解反应的进行，牛骨胶原蛋白结构逐渐打开，分子表面C=O、CONH2、COOH逐步增多，胶原蛋白肽中生色基团分布也随之发生变化，释放出隐藏在分子内的疏水基团，同时游离出脯氨酸残基和赖氨酸残基，使降解后的胶原蛋白肽热稳定性增强；降解产物胶原蛋白肽的肽链上-NH2+-排斥作用逐渐减弱，疏水氨基酸残基作用增强，分子内与分子间的氢键作用也不断加大，N-H伸缩振动与氢键形成了缔合体，并且降解作用促进β-转角的产生，同时破坏了牛骨胶原蛋白的表面分子结构，使其变的疏松。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 动物骨骼的研究现状

1.2 胶原蛋白研究进展

1.3 胶原蛋白肽的研究进展

1.4 蛋白酶的研究现状

1.5 立题背景和意义

1.6 主要研究内容

第2章 B. cereus MBL13-U发酵制备胶原蛋白酶工艺优化

2.1 材料与设备

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 小结

第3章 胶原蛋白酶的分离纯化及特性分析

3.1 材料与设备

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 小结

第4章 CSCD酶降解牛骨胶原蛋白的工艺优化

4.1 材料与设备

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 小结

第5章 CSCD酶降解牛骨胶原蛋白的动力学模型构建

5.1 材料与设备

5.2 方法

5.3 结果与分析

5.4 小结

第6章 CSCD酶对牛骨胶原蛋白降解机理的初步探讨

6.1 材料与设备

6.2 方法

6.3 结果与分析

6.4 小结

第7章 结论与展望

7.1 结论

7.2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间的研究成果