食管鳞癌中候选抑癌蛋白14-3-3σ结合蛋白的蛋白质组研究

摘要

背景 食管癌(Esophageal carcinoma，EC)是世界六大恶性肿瘤之一，其主要流行病学特征是显著的地域性分布差异，高低发区发病率相差高达500倍，并且预后极差，中晚期患者5年生存率仅为10％左右。河南林州市是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区之一。过去几十年，尽管我国老一代科学家在这些地区进行了多学科、系统性综合研究，提出食管癌变是一个多阶段进行性发展的过程，但是目前该地区人群食管癌的发病率和死亡率一直未得到明显改善，仍然是该地区人群肿瘤相关疾病的主要死亡原因之一。其主要原因包括：①对食管癌的确切发病因素尚不十分清楚，缺乏有效的I、II级预防手段和措施；②食管癌变多阶段演进的分子机制尚不清楚，缺乏敏感、特异的早期诊断和生物防治的指标和方法。食管原位癌和粘膜内癌患者的手术后五年生存率可分别达到100％和95％，因此，提高食管癌治疗效果的关键在于早期发现、早期诊断和早期治疗。 14-3-3σ是一新的候选抑癌基因，它的表达产物通过结合并调节多种靶蛋白而参与细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程。14-3-3σ蛋白的低表达与人类多种肿瘤发生发展相关，如乳腺、膀胱、前列腺、肝、肺等多部位多组织类型的肿瘤。但有关14-3-3σ与食管癌之间的关系报道甚少。我们前期研究发现14-3-3σ在食管鳞癌细胞系和食管鳞癌组织中表达显著下降，并与鳞癌分化程度密切相关。 本研究首先从食管永生化细胞系NE6中克隆14-3-3σ全长编码基因，经测序验证后，构建pcDNA3.2-14-3-3σ-TAP(C)真核表达载体并转染食管鳞癌细胞系，采用串联亲和纯化、高解析离子淌度质谱(High Definition Mass Spectrometry，HDMS)等技术分离、鉴定与14-3-3σ蛋白结合的蛋白复合体组分，进一步探讨14-3-3σ在食管鳞癌多阶段演进过程中抑癌作用的分子机制，也为食管癌高发区人群筛查和食管癌早期诊断提供更多候选分子指标。 目的： 通过研究与14-3-3σ蛋白结合的蛋白复合体中的组分及各成员蛋白质分子的功能，阐明候选肿瘤抑制基因14-3-3σ在食管鳞癌中发挥抑癌作用的分子机制，为进一步明晰食管鳞癌多分子、多阶段演进分子机制和建立高危人群筛查和早期诊断的生物指标和手段奠定工作基础。 方法： 从食管上皮永生化细胞NE6中提取mRNA并反转录成cDNA，利用RT-PCR技术扩增含有全长14-3-3σ基因(747bp)的cDNA，又用定点突变方法对其119和686两个错误碱基进行修正，将其定向插入真核表达载体pcDNA3.2，经测序确定载体构建成功后，用脂质体稳定转染食管鳞癌细胞系；Western blotting检测食管鳞癌细胞系确证转染成功并表达14-3-3σ-TAP(C)融合蛋白；温和裂解表达14-3-3σ-TAP(C)融合蛋白以及空载体的食管鳞癌细胞，提取总蛋白；利用串联亲和纯化技术(TAP)分离14-3-3σ结合蛋白复合体；复合体变性裂解后进行SDS-PAGE电泳，银染后切取差异条带，胶内胰酶酶切蛋白为肽段，HDMS测定14-3-3σ-TAP(C)蛋白复合体组份，经蛋白数据库检索确定与14-3-3σ特异结合的蛋白质分子。 结果： 1.从食管上皮永生化细胞NE6中得到了14-3-3σ全长基因，定点突变纠正其错误碱基后与pubmed数据库匹配，验证序列准确无误； 2.构建了14-3-3σ真核表达载体并转染食管鳞癌细胞系EC9706，获得pcDNA3.2-BioEase-TEV-His-V5-14-3-3σ(NT)、pcDNA3.2-14-3-3σ(CT)-V5-His-TEV-BioEase的亚细胞系以及不表达14-3-3σ的空载体pcDNA3.2-BioEase-TEV-His-V5对照细胞系； 3.对14-3-3σ蛋白复合体串联亲和纯化后，SDS-PAGE凝胶电泳进行一维分离，切下差异条带，胶内酶切并利用HDMS测定得到了14-3-3σ-TAP(C)蛋白复合体中的各个组分； 4.同转染空载体的细胞株纯化结果相比较，利用削减法排除非特异结合蛋白，得到57个同14-3-3σ蛋白相互作用的蛋白，并对其进行了功能分析和评价。 结论： 本研究以与14-3-3σ蛋白结合的蛋白质复合体为切入点，运用先进的蛋白质组学技术，鉴定了食管鳞癌细胞系中57个与14-3-3σ蛋白有关的细胞信号蛋白，这将为今后进一步阐明14-3-3σ蛋白在食管鳞癌发生发展过程中抑癌作用的分子机制奠定重要的工作基础，为食管癌高发地区高危人群的筛查和早期诊断提供更多的候选分子指标。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

2材料、试剂与仪器

2.1菌株和细胞株

2.2主要试剂及配制

2.3主要仪器

2.4引物设计

2.4.1 14-3-3σ基因全长引物

2.4.2排除野生型方法基因突变的引物设计

2.4.3插入pENTRTM TOPO(R)载体序列引物

3方法与步骤

3.1总RNA的提取

3.2 RT-PCR扩增14-3-3σ基因

3.3 PCR产物凝胶回收

3.4.连接测序载体和转化大肠杆菌

3.5挑取及鉴定阳性克隆

3.6质粒提取

3.7排除野生型法修正突变基因

3.8真核表达载体的构建

3.9食管鳞癌细胞系EC9706对G418敏感性实验

3.10脂质体稳定转染EC9706细胞株

3.11免疫印迹技术(Western blotting)检测转染细胞中的标签蛋白

3.11.1细胞总蛋白的提取

3.11.2总蛋白定量(BCA法)

3.11.3 蛋 白质凝胶电泳

3.11.4 Western blotting蛋白转印

3.11.5 Western blotting检测蛋白复合体中V5标签蛋白

3.12串联亲和纯化(TAP)14-3-3σ蛋白复合体

3.12.1细胞准备及总蛋白的提取

3.12.2链霉素柱子的准备

3.12.3复合体的结合

3.12.4洗涤

3.12.5 AcTEVTM酶切

3.12.6蛋白复合体洗脱

3.12.7超滤去除AcTEVTM酶

3.13纯化蛋白银染鉴定差异蛋白

3.14脱银、胶内酶切

3.15 质谱鉴定

4 结果

4.1 RT-PCR扩增14-3-3σ全长基因

4.2真核表达载体的构建

4.3表达pcDNA3-2载体稳定细胞株的建立及鉴定

4.4 SDS-PAGE检测差异条带

4.5差异条带的胶内酶切和质谱鉴定

5 讨论

6结论

参考文献

文献综述14-3-3蛋白的结构、功能和研究进展

附 录英文缩略词表(ABBREVIATION)

致 谢

在读期间发表的学术论文及研究成果