DR5抗体诱导白血病细胞系凋亡与DR5表达

摘要

背景:
　　 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是1995年Wiley等发现的TNF超家族成员，能够诱导多种肿瘤细胞凋亡而对大多数正常细胞无影响。TRAIL通过与肿瘤细胞膜上的相应受体结合诱导细胞凋亡，目前发现TRAIL有5种类型的受体，其中TRAIL受体1(死亡受体4，deathreceptor4，DR4)和RAIL受体2(死亡受体5，death receptor5，DR5)胞内段含有死亡结构域，能够传递凋亡信号，其他三种受体：TRAIL受体3(DcRl)、TRAIL受体4(DcR2)和OPG(Osteoprotegerin)可阻断TRAIL诱导的凋亡，称为“诱骗”受体。虽然天然TRAIL有良好的抗肿瘤作用，但实验发现某些rhTRAIL对正常肝细胞等有细胞毒性，这使人们对其生物安全性产生了怀疑。研究发现一些抗DR4或DR5的功能性单克隆抗体(mAb)能够模拟TRAIL的作用，诱导肿瘤细胞凋亡，且无肝细胞毒性，因此抗人DR4和DR5的功能性单克隆抗体(mAb)成为目前TRAIL肿瘤生物治疗的新靶点。我们利用重组人DR5蛋白免疫BALB/c小鼠，制备了功能性抗DR5单克隆抗体-mDRA-6，前期研究表明mDRA-6可有效诱导多种肿瘤细胞凋亡，同时发现不同肿瘤细胞对其敏感性存有较大差异。虽然肿瘤细胞对mDRA-6敏感性的高低可能与细胞DR5表达、细胞内凋亡信号分子数量及激活状态、细胞内抗凋亡分子变化等诸因素有关，但mDRA-6与细胞DR5结合是启动细胞凋亡的前提，因此推测细胞DR5表达水平是影响mDRA-6诱导细胞凋亡的重要因素。本研究通过分析白血病细胞DR5表达与mDRA-6诱导细胞凋亡的关系，探讨提高细胞DR5表达是增强mDRA-6凋亡诱导作用的有效途径。
　　 目的:
　　 检测不同白血病细胞系细胞表面DR5表达、细胞DR5蛋白表达、细胞DR5mRNA表达水平，分析抗人DR5单克隆抗体mDRA-6诱导白血病细胞凋亡与细胞DR5表达的关系。观察维生素E琥珀酸酯(Vitamin E Succinate;VES)对白血病细胞DR5表达的影响，探讨VES增加mDRA-6诱导白血病细胞凋亡作用及可能机制。
　　 方法:
　　 MTT法检测mDRA-6对白血病细胞Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞的生长抑制作用；Annexin V-FITC/PI双染定量分析白血病细胞凋亡；流式细胞术检测细胞表面DR5表达；免疫印迹技术(Western blotting)检测细胞DR5蛋白表达情况；RT-PCR法检测细胞DR5mRNA表达。
　　 结果;
　　 1.MTT检测表明，浓度为10μg/ml的mDRA-6作用12h，白血病Jurkat、U937、HL-60、Raji细胞死亡率分别为88.25％，61.43％，59.76％，21.98％，K562的细胞死亡率仅为5.23％。5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的VES与mDRA-6分别共同作用于Raji和K562细胞，Raji细胞死亡率分别增加至24.67％(P＞0.05)、35.65％(P＜0.01)和40.22％(P＜0.01)；K562细胞死亡率增加至6.00％(P＞0.05)、7.89％(P＜0.01)、8.67％(P＜0.01)。
　　 2.Annexin V/PI双染检测5μg/ml的mDRA-6作用白血病细胞12h，Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞凋亡率分别为85.96％、50.22％、48.11％、23.40％和7.20％。2μg/ml的mDRA-6单独作用Raji、K562细胞16h，细胞凋亡率分别为20.79％和7.74％，2μg/ml的mDRA-6与10μmol/L的VES共同作用Raji、K562细胞16h，细胞凋亡率分别增至43.18％和16.99％。
　　 3.白血病细胞Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞表面DR5表达分别为94.8％、74.71％、58.66％、42.35％和14.92％；Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞表面DR5表达与mDRA-6诱导的细胞凋亡呈明显正相关(r=0.9712，t=7.063，p＜0.01)。10μmol/L的VES作用Raji、K562细胞12h后，细胞膜DR5表达率分别增加至70.08％和16.38％。
　　 4.免疫印迹技术检测显示，细胞DR5蛋白表达强弱依次为Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562。Raji和K562细胞DR5蛋白基础表达量较少，5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的VES分别作用于Raji和K562细胞12h，Raji和K562细胞DR5蛋白表达量均增加，10μmol/L、20μmol/L的VES诱导DR5蛋白表达增加显著。
　　 5.白血病细胞系Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞DR5mRNA相对量分别为：306.82±106.36，214.48±93.56，198.47±78.45，123.68±67.23，45.29±26.39；Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞DR5mRNA表达与mDRA-6诱导的细胞凋亡呈明显正相关(r=0.9915，t=13.22，p＜0.01)。20μmol/L的VES作用Raji细胞12h，细胞DR5mRNA表达显著增加(p＜0.05)，5μmol/L、10μmol/L的VES作用Raji细胞12h及5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的VES作用K562细胞12h，虽能使细胞DR5 mRNA表达增加，但无统计学意义。
　　 结论:
　　 1.mDRA-6能够诱导人白血病Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞凋亡，但不同白血病细胞系细胞对mDRA-6的敏感性不同。Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞表面DR5表达及DR5mRNA表达与mDRA-6诱导的细胞凋亡呈明显正相关，白血病细胞系细胞对mDRA-6的敏感性不同与细胞DR5表达差异有关。
　　 2.VES增加Raji和K562细胞膜DR5表达、DR5蛋白表达及DR5mRNA表达，同时能够增强mDRA-6对白血病细胞系Raji和K562细胞的凋亡诱导作用。VES增加Raji和K562细胞DR5表达可能是其增强mDRA-6凋亡诱导作用的机制之一。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

第一部分抗DR5抗体诱导白血病细胞系凋亡与DR5表达

1前言

2材料

2.1细胞

2.2 DR5单克隆抗体与质粒

2.3主要试剂

2.4液体配制

2.5主要仪器设备

3方法

4结果

第二部分维生素E琥珀酸酯增加白血病细胞DR5表达和mDRA-6的凋亡作用

1前言

2材料

3方法

4结果

5讨论

参考文献

结论

文献综述：TRAIL及其受体与细胞凋亡研究进展

附录：主要缩略语

在读期间发表的学术论文与研究成果

致谢