金黄色葡萄球菌GapC蛋白的表达与免疫原性研究

摘要

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus，S. aureus)是引起人和动物多种疾病的重要致病菌。由于不同S. aureus菌株间缺乏共同的保护性抗原，目前研究的S. aureus疫苗在临床试验中应用效果并不理想。研究表明甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)蛋白可作为抗寄生虫和微生物感染的疫苗抗原。因而，本研究利用S. aureus表面具有GAPDH活性的保守性GapC蛋白制备免疫原，探讨其免疫原性，及其对S.aureus感染的免疫保护作用。 本研究首先通过PCR方法扩增S.aureus菌株。BMSA/855/23-1的gapC基因，随后将其克隆到pMD18-T载体上。重组克隆pMD-T/gapC经测序后，与GenBank上已发表的序列进行对比分析。然后，将gapC基因插入到pQE-30载体上，构建重组质粒pQE30/gapC。重组质粒转化大肠杆菌E.coliM15(pREP4)，IPTG诱导后，SDS-PAGE鉴定GapC融合蛋白的表达。重组蛋白经纯化后进行GAPDH活性检测和Western blot检测，确定其GAPDH活性及特异性抗体结合活性。25只健康家兔随机分成5组，分别用重组蛋白、全菌体灭活菌苗及对照剂(PBS)对其进行免疫。应用ELISA方法检测血清中lgG抗体水平及加强免疫第14d血清中IFN-γ、IL-4细胞因子浓度。最后，用S.aureus菌株Wood46对免疫兔攻毒，观察攻毒后家兔的临床症状、病理变化，对试验兔的肝、脾及肾脏进行细菌分离鉴定，确定其发病情况，进而评价GapC蛋白的免疫保护效果。 结果本研究成功扩增并克隆了S.aureus BMSA/855/23-1株的gapC基因，该菌株的gapC基因与GenBank上S.aureus BM10株的核苷酸序列一致性为99.3％，推导氨基酸序列一致性为99.4％。SDS-PAGE结果表明，重组质粒pQE30/gapC在E.coli M15(pREP4)中成功表达，GAPDH活性检测及Western Blot检测表明重组蛋白具有较高的GAPDH活性和抗原性。GapC蛋白及全菌体组兔血清中抗IgG抗体水平在加强免疫后第28d达到最高(1：64000)。加强免疫后第14d血清中细胞因子IFN-γ和IL-4浓度与对照组相比，显著升高(p<0.05)；而全菌体免疫组细胞因子浓度升高不明显(p>0.05)。在加强免疫第10d，用5×10<'7>CFU/mL .S. aureus对家兔进行攻毒，结果蛋白免疫组家兔中仅有1只家兔发病(1/5)。 以上结果表明，表达的重组GapC蛋白具有GAPDH活性、免疫原性及较好的免疫保护力。可作为深入研究S.aureus基因工程疫苗的良好靶向。

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文摘

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论文说明：英文缩略语表

声明

第一章文献综述

1.1引言

1.2 S.aureus的致病机制

1.3 S.aureus疫苗的研究进展

1.4S.aureus Gap蛋白的特性与应用

1.5 GAPDH的新功能

1.6小结

第二章材料与方法

2.1材料

2.2方法

第三章结果

3.1 S.aureus gapC基因的PCR扩增结果

3.2 S.aureus gapC基因的T-A克隆及序列测定结果

3.3 gapC基因重组表达载体的构建结果

3.4重组GapC蛋白的表达及纯化结果

3.5重组GapC蛋白的GAPDH活性测定结果

3.6重组GapC蛋白的Western Blot结果

3.7重组GapC蛋白的免疫效果

3.8 GapC重组蛋白的免疫保护结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

致谢

附录

作者简历