奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌基因工程蛋白的纯化及其免疫原性研究

摘要

奶牛乳腺炎(Mastitis)是造成奶牛业经济损失的最主要原因之一，而且还给人类的健康带来了潜在的危害。目前，引起奶牛乳腺炎的病原菌众多，且治疗时大量抗生素的使用不但使奶牛对病原菌产生抗性，而且抗生素的残留问题也日益影响着食品卫生安全和人类健康。利用疫苗来预防和控制奶牛乳腺炎是一种安全、经济、有效的方法。两年来，研究人员对山东省奶牛场临床型乳腺炎的流行病学进行了较为细致的研究，证实金黄色葡萄球菌是引起该地区奶牛乳腺炎的主要病原菌。本课题针对引起奶牛乳腺炎的主要病原菌金黄色葡萄球菌α-溶血素和FnbpA黏附素基因工程蛋白进行了分离纯化及活性检测，并制备了与其相对应的基因工程亚单位疫苗。通过建立小自鼠试验模型对疫苗的免疫效力进行了评估。本研究分为四部分： 试验一不同纯化方法得到的基因工程蛋白金黄色葡萄球菌α-溶血素的生物学特性比较 以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表达的重组金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白作为研究对象，分析比较通过凝胶过滤层析(Gel FiltrationChromatography)和镍柱亲和层析纯化试剂盒(Ni-NTA Spin Columns)纯化所得到的重组蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差异。SDS-PAGE分析检测纯化产物，Bradford法测定蛋白含量，兔红细胞测定半数溶血效价。结果显示这两种方法得到的纯化产物在53 kD处均呈现单一清晰带，达电泳级纯度。与此同时，凝胶过滤对目的蛋白的纯化率为14.04％，蛋白含量为0.337 mg/mL，溶血活性为1519HU/mg；镍柱亲和层析的纯化率为17.5％，蛋白含量为0.35 mg/mL，溶血活性为1463HU/mg。由此可见，凝胶过滤得到的纯化产物在蛋白含量和蛋白活性方面丝毫不亚于镍柱亲和层析纯化试剂盒，而且减少了实验室经费支出。 试验二金黄色葡萄球菌α-溶血素和FnbpA黏附素基因工程蛋白的分离纯化及活性检测 金黄色葡萄球菌毒素基因流行情况的调查报道显示，金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素和凝固酶能协同作用引发小鼠乳腺炎。其分泌的黏附素能识别细胞表面组分并与之结合，促使细菌粘附到细胞表面，从而定居和繁殖。这两种毒素在金黄色葡萄球菌感染及致病的过程中具有重要作用。本试验将成功表达的α-溶血素和黏附素蛋白从表达宿主菌株中通过凝胶过滤层析法分离纯化出来并检测其生物学活性。 试验三奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌α-溶血素基因工程疫苗的制备及实验室免疫效力评价 以小白鼠为试验模型，检测金黄色葡萄球菌α-溶血素基因工程蛋白亚单位疫苗的抗体效价和免疫保护力，初步评价此亚单位疫苗的免疫效力。我们建立了ELISA方法测定抗体效价，并且通过攻毒得出疫苗免疫保护力。所有试验小鼠在首免一周后采集的血清中都检测到了特异性抗体，抗体效价呈逐渐上升趋势，达最高值后逐渐降低，由此可见蛋白疫苗作用机体产生的抗体水平符合抗体消长规律。 试验四奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌FnbpA基因工程疫苗的制备及实验室免疫效力评价 以小白鼠为试验模型，检测金黄色葡萄球菌FnbpA基因工程蛋白亚单位疫苗的抗体效价水平和免疫保护力。培养MDBK细胞通过吸附抑制试验检测蛋白活性，建立ELISA方法检测被免疫的小鼠血清中抗体效价，并且通过腹腔攻毒得出疫苗免疫保护得到力。结果细菌黏附抑制试验发现被目的蛋白预处理过的MDBK细胞周围的金黄色葡萄球菌数量明显减少，差异显著：所有试验小鼠在首免一周后采集的血清中都检测到了特异性抗体，而抗体效价开始时呈逐渐上升趋势，达最高值后随时间延长逐渐降低，蛋白疫苗作用机体产生的抗体水平符合抗体消长规律且表现了良好的免疫保护力。

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文摘

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引言

1 奶牛乳腺炎的研究进展

1.1奶牛乳腺炎的危害及其损失

1.2奶牛乳腺炎的病原及发病机理

1.3奶牛乳腺炎的类型及临床症状表现

1.4奶牛乳腺炎的检测和诊断方法

1.5奶牛乳腺炎的综合防治

2 奶牛乳腺免疫机制和乳腺炎疫苗的研究进展

2.1奶牛乳腺免疫及防御机制

2.2乳腺炎疫苗的研究现状

3 本课题研究的目的与意义

试验一不同纯化方法得到的基因工程蛋白金黄色葡萄球菌α-溶血素的生物学特性比较

1材料与方法

2结果

3讨论

试验二 金黄色葡萄球菌α-溶血素和FnbpA黏附素基因工程蛋白的分离纯化及活性检测

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

试验三 奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌α-溶血素基因工程疫苗的制备及实验室免疫效力评价

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

试验四奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌FnbpA基因工程疫苗的制备及实验室免疫效力评价

1材料与分析

2结果与分析

3讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况