神经生长因子对SCG神经元兴奋性以及M电流和Na电流调节的研究

摘要

鉴于M通道、Na通道和NGF均具有重要的生理和病理生理意义，本实验以分离培养的大鼠颈上神经节神经元(SuperiorCervicalGanglionneurons，SCGneurons)为平台，观察了NGF对神经元兴奋性的影响以及NGF对M通道和Na通道的作用，初步探讨了NGF对二者产生作用的分子机制。 目的：分离培养大鼠SCG神经元，利用膜片钳技术记录神经元动作电位和通道电流，(1)观察NGF对SCG神经元兴奋性的影响；(2)确定NGF是通过作用于何种离子通道进而调节神经元兴奋性；(3)初步探讨NGF对离子通道作用的机制。 方法：(1)SCG神经元的分离与培养：取4-6周龄的SD雄性大鼠，迅速摘取其颈上神经节，经过剪切、消化、洗酶、重悬、种植等过程，生化培养箱37℃，5％CO2+95％混合气，培养1d后用于膜片钳记录。2d内做完。要求：无菌，低温，操作迅速。(2)电生理学实验：利用打孔膜片钳技术和全细胞膜片技术，记录神经元动作电位和离子通道电流，急性给予NGF，观察NGF对神经元兴奋性和通道电流的作用并分析其作用机制。要求：①相同条件的灌流给药和②严格有效的实验对照。 结果：(1)短时间内(～2min)应用NGF，能增强神经元兴奋性，表现为动作电位频率升高；延长NGF应用时间(～10min)，反而抑制神经元兴奋性，表现为动作电位频率降低。长时间冲洗NGF后，兴奋性没有恢复或很难恢复。统计数据显示，短时间内应用NGF使神经元兴奋性增强1.6倍；而长时间应用NGF可使神经元兴奋性降低至原来的43％。二者分别与对照相比，均有统计学意义。(2)急性应用(～2min)NGF能迅速抑制M电流，抑制率达42.8％±3.8％(n=6)，其电流抑制的特征颇类似于乙酰胆碱对M电流的抑制；长时间冲洗NGF后，M电流没有(或很难)从抑制作用中恢复，这与乙酰胆碱对M电流的抑制有区别。统计数据显示，应用NGF前后相比，二者之间有显著的统计学差异。(3)预先应用(电极内应用)TrkA受体的特异性阻断剂AG879，待其扩散3-5min后，再给予NGF。观察发现AG879可明显降低NGF对M电流的抑制作用，使其抑制率从42.8％±3.8％(n=6)降至17％±3.1％(n=7)。统计数据显示，在AG879存在情况下应用NGF和对照相比，二者之间有统计学差异。(4)预先应用磷脂酶C(PLC)的抑制剂U73122，再给予NGF。观察发现U73122能显著消弱NGF对M电流的抑制作用，使其抑制作用从40.9％±6.9％(n=5)降低至12.2％±4.6％(n=5)。统计数据表明，在U7312存在情况下应用NGF和对照相比，二者之间有显著的统计学差异。(5)预先应用酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein，在其存在的情况下，再给予NGF。观察发现Genistein可明显减弱NGF对M电流的抑制作用，使其抑制率从33.4％±3.2％(n=5)降至7.4％±4.1％(n=7)。统计数据显示，在Genisten存在情况下应用NGF和对照相比，二者之间有明显的统计学差异。(6)急性灌流NGF(～10min)，可显著抑制Na电流，抑制率达41.5％±6.2％(n=7)；与其抑制M电流相比，有相对缓慢和明显延迟的特征。给予NGF后，一般在2min后才发挥抑制作用，而且长时间冲洗NGF后，Na电流没有(或很难)从抑制中恢复。统计数据显示，应用NGF前后相比，二者之间有显著的统计学差异。药理学鉴定显示，SCG神经元的Na电流是一种TTX敏感型Na电流，因TTX可完全抑制之。(7)预先给予酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein，再应用NGF。观察发现Genistein可显著减弱NGF对神经元Na电流的抑制作用，使其抑制率从41.5％±6.2％(n=7)降至15.8％±11.2％(n=3)。统计数据显示，在Genisten存在情况下应用NGF和对照相比，二者之间有统计学差异。值得注意的是，Genistein本身对SCG神经元Na电流有强烈的抑制作用，冲洗后还能迅速恢复。(8)M受体激动剂oxotremorinemethiodide(oxo-M)，也能活化PLC引起膜磷脂PIP2的水解和下游信号蛋白PKC的激活。给予oxo-M(～10min)对SCG神经元Na电流没有作用，这和前人的工作有所不同。前人的工作提示，在海马CA1区神经元，乙酰胆碱通过M受体激活下游信号蛋白PKC，PKC可通过将神经元Na通道(Nav1.2)的第1506位丝氨酸磷酸化而抑制Na电流。(9)预先给予酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein，再应用NGF，Genistein取消了NGF对神经元兴奋性的影响。统计数据显示，在Genistein存在的情况下，应用NGF前后相比，神经元兴奋性的变化没有统计学差异。有趣的是，Genistein本身可强烈抑制神经元兴奋性，使动作电位发放次数见明显减少，这可能因其强烈抑制Na电流所致。 结论：(1)NGF对SCG神经元兴奋性有双重调节作用。表现为NGF短时间内(～2min)增强神经元兴奋性，长时间内(～10min)抑制神经元兴奋性。(2)NGF对SCG神经元M电流的急性(～2min内)抑制作用，导致神经元兴奋性的增强。(3)NGF对M电流的抑制作用，是通过其特异性受体TrkA介导产生的。(4)NGF激活的两个细胞内过程——PLC介导的膜磷脂PIP2的水解和酪氨酸磷酸化作用——参与了NGF对M电流的抑制。(5)NGF对SCG神经元Na电流的抑制作用，导致兴奋性的抑制。此Na电流是TTX敏感性Na电流，因TTX可完全抑制之。(6)NGF激活的细胞内酪氨酸磷酸化作用参与了NGF对Na电流的抑制，而PLC介导的膜磷脂PIP2的水解及其下游效应器酶PKC没有参与此作用。(7)药理学阻断剂进一步证明，NGF先后抑制神经元的M电流和Na电流，是其对神经元兴奋性产生双重调节作用(先增强后抑制作用)的原因。因为Genistein既能显著消弱NGF对神经元M电流的抑制，也能有效降低NGF对神经元Na电流的抑制，所以给予Genistein，有效消除了NGF对神经元兴奋性的影响。充分证明NGF对神经元兴奋性的双重调节是由于先后抑制M电流和Na电流的结果。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历