大黄酸衍生物RH-01的抑制骨肉瘤生长作用及其作用机制研究

摘要

本实验室对大黄蒽醌成分大黄酸和传统抗肿瘤药鬼臼毒素进行了相应的化学结构改造，得到了大黄酸衍生物RH-01，在初筛和复筛过程中发现，RH-01在体外对人源骨肉瘤HOS细胞有较强的生长抑制作用，且具有良好的量效关系。 本实验目的：本实验进一步研究RH-01对体外培养的人源骨肉瘤HOS细胞和动物移植性肿瘤的抑制作用及特点，并初步探讨其作用机制。 方法：用96孔培养板接种对数生长期HOS细胞，培养24h后入药物RH-01(0.05～0.8μmol/L)，96h后MTT法测定RH-01在体外对HOS细胞的生长抑制率；同样根据MTT法，记录不同浓度(0.05～0.8μmol/L)的RH-01分别在0h、24h、48h和72h的光密度值(OD)，并绘制细胞生长曲线，观察不同浓度RH-01对HOS细胞的生长抑制作用。 在对数生长期细胞中加入含有不同浓度(0.0625～0.25μmol/L)的RH-01，24h后弃上清，PBS洗一次，4℃，4％多聚甲醛固定细胞30分钟，晾干，加入Hoechst33342(终浓度为10μg/ml)，37℃染色5～10分钟，水冲净，晾干后以紫外光(340nm)激发Hoechst，荧光显微镜观察照相并保留结果。 昆明鼠体内移植实体型S180肉瘤，接种S180肉瘤24h后，连续给RH-01(30mg/kg/d和60mg/kg/d)10天，然后处死动物，取瘤子并称重，确定RH-01对实体瘤S180肉瘤的治疗作用。 用无水乙醇溶解四环素和RH-01，定溶至0.125mmol/L，各取样品3份，分别向其中加入25mg羟基磷灰石，各样品在超声波振荡器振荡1min后，室温平衡16h，过滤后测定羟基磷灰石对四环素和RH-01的吸附值；昆明鼠腹腔分别给0.01mmol/L的鬼臼毒素和0.02mmol/L的RH-01(鬼臼毒素和大黄酸按1∶1量合成，理论上，鬼臼毒素的量应是相等的)，分别在12h和24h紫外分光光度仪(254nm)测定骨对RH-01吸收情况和光谱图，并测定鬼臼毒素、大黄酸、RH-01在体外的光谱图，进行体内外光谱图比较，以RH-01转运至骨内的鬼酒毒素量来确定RH-01是否具有骨靶向作用。 收集对数生长期的HOS细胞，加入药物RH-01(0.0625～0.25μmol/L)，继续培养24h后，PBS冲洗细胞，70％无水乙醇固定24h，PI染色后，用流式细胞仪检测不同浓度的(0.0625～0.25μmol/L)RH-01作用12h、24h和36h后对HOS细胞的影响。 收集对数生长期的HOS细胞，加入药物RH-01(0.0625～0.25μmol/L)，次日，先后加抗微管蛋白的抗体：α-tubulin(1∶2000)和荧光素标记的抗小鼠二抗，在380nm紫外光激发下观察HOS细胞的微管蛋白变化并照相。从新鲜猪脑中提取微管蛋白，用分光光度计和自动记录仪在波长为350nm下测定化合物RH-01对微管蛋白的作用，并作时间-吸光度曲线，根据时间—吸光度曲线确定RH-01对微管活性的影响。 用RT-PCR和PCR方法检测经不同浓度(0.0625～0.25μmol/L)的RH-01作用24h后，RH-01对HOS细胞的周期素蛋白cyclinD1mRNA和周期素蛋白依赖蛋白激酶CDK4mRNA表达的影响。 结论：本室合成的化合物RH-01在体外能够抑制骨肉瘤HOS细胞生长，体内能够抑制实体瘤S180肉瘤的生长；通过抑制微管的聚合，破坏细胞骨架，通过下调细胞周期素cyclinD1和细胞周期依赖性蛋白激酶CDK4基因的表达，对HOS细胞进行细胞周期驱动机制的调控，从而抑制骨肉瘤细胞生长，并且通过体内外吸附实验也证实RH-01有很强的骨靶向作用，因此本化合物有望成为一个对骨肉瘤有针对性作用的新型的抗肿瘤先导化合物。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 大黄酸抗肿瘤作用的研究进展

致谢

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