靶向RAC1蛋白的大黄酸衍生物4L合成及对卵巢癌细胞的生长抑制作用

摘要

目的:
　　以抑制卵巢癌浸润转移的RAC1蛋白为潜在靶点，利用分子对接辅助设计软件，对先导化合物大黄酸的母体结构进行修饰并合成大黄酸衍生物，探讨新合成衍生物对卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制作用以及靶向调控机制。
　　方法:
　　1.基于RAC1靶点，利用分子对接软件，对大黄酸进行结构修饰合成大黄酸衍生物，利用紫外分光光度计、多功能酶标仪测定衍生物的紫外可见光吸收光谱、荧光激发光谱、荧光发射光谱，激光共聚焦显微镜观察衍生物在卵巢癌SKOV3细胞内的分布，高效液相色谱仪检测SKOV3细胞对合成衍生物的摄取量。
　　2.采用MTT法检测衍生物对SKOV3细胞的生长抑制作用，HE染色观察衍生物4L对SKOV3细胞形态的影响，利用流式细胞仪检测衍生物4L对SKOV3细胞诱导凋亡情况，划痕实验检测衍生物对SKOV3细胞迁移能力的影响，Transwell实验检测衍生物对SKOV3细胞侵袭能力的影响。
　　3.Western blot法检测衍生物作用于SKOV3细胞后RAC1的表达情况的变化，根据荧光素酶报告基因系统原理构建含RAC1基因启动子和荧光素酶报告基因的慢病毒载体，转染SKOV3细胞株后经筛选获得SKOV3-RAC1-LUC细胞株，采用荧光素酶报告系统检测衍生物靶向调控RAC1的活性。
　　结果:
　　1.成功合成了大黄酸衍生物4L，分子对接结果示:大黄酸、中间化合物X以及衍生物4L均可以与靶蛋白RAC1发生相互作用，其结合能分别为-13.00kcal/mol，-10.35kcal/mol，-16.96kcal/mol，衍生物4L和RAC1的相互作用更加紧密。大黄酸和衍生物4L的最大紫外吸收波长分别为261nm和262nm，大黄酸的最大激发波长为460nm，最大发射波长为640nm，衍生物4L的最大激发波长为470nm，最大发射波长为540nm;衍生物4L不仅可以结合卵巢癌SKOV3细胞的细胞膜，还能进入细胞内，主要分布在细胞质中，进入细胞核的较少;卵巢癌SKOV3细胞对相同的作用浓度的大黄酸以及衍生物4L摄取量分别为1.34±0.34μg/mg和116.14±1.43μg/mg，对衍生物4L的摄取量明显高于大黄酸(P＜0.001)。
　　2.衍生物4L作用卵巢癌SKOV3细胞48h后可明显抑制其增殖，且抑制作用随着药物浓度的增加而递增，其IC50为9.977μg/mL，明显低于大黄酸的IC50为17.338μg/mL;显微镜下可见HE染色后，随着药物浓度的升高SKOV3细胞的数量减少，核质比提高，细胞皱缩;衍生物4L作用于SKOV3细胞后48h后可显著诱导细胞的凋亡，且抑制作用呈浓度依赖性，4L能抑制SKOV3细胞的迁移和侵袭。
　　3.Western Blot实验表明衍生物4L能降低SKOV3细胞的RAC1蛋白的表达且抑制作用呈剂量依赖性，成功构建含RAC1基因启动子荧光素酶报告基因的慢病毒表达载体，测序结果显示插入序列正确。经转染筛选获得稳转SKOV3-RAC1-LUC细胞株，荧光素酶实验表明衍生物4L可以靶向抑制卵巢癌SKOV3细胞的RAC1蛋白的表达。
　　结论:
　　1.卵巢癌SKOV3细胞对衍生物4L的摄取量高于先导化合物大黄酸，说明对大黄酸进行了有效的结构改造。
　　2.大黄酸衍生物4L能抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖，诱导SKOV3细胞的凋亡，抑制卵巢癌细胞的浸润、转移。
　　3.大黄酸衍生物4L可以通过靶向抑制卵巢癌SKOV3细胞的RAC1蛋白的表达抑制卵巢癌细胞的浸润、转移，可能是一种靶向RAC1的小分子抑制剂。

目录

声明

个人简历

英文缩略词

摘要

第一章 靶向RAC1蛋白大黄酸衍生物的合成与理化性质

前言

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第二章 大黄酸衍生物4L对卵巢癌细胞的生物学行为的影响

前言

5．实验材料

6．实验方法

7．实验结果

8．讨论

第三章 大黄酸衍生物4L抑制卵巢癌细胞作用机制及靶点验证

前言

9．实验材料

10．实验方法

11．实验结果

12．讨论

不足与展望

全文小结

本研究创新之处

综述 卵巢癌靶向治疗研究进展

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文