2型糖尿病大鼠心肌纤维化的炎症机制及阿托伐他汀、罗格列酮及二者联合对心肌的保护作用

摘要

糖尿病心肌病是一种独立的糖尿病心血管并发症，与糖尿病患者的高心力衰竭发生率和高死亡率密切相关。本研究通过高糖，高脂饮食加腹腔注射小剂量STZ的方法，制成2型糖尿病大鼠模型。我们选择目前广泛应用于临床的噻唑烷二酮类药物-罗格列酮(Rosiglitazone，Rsg)和他汀类药物一阿托伐他汀(Atorvastatin，Ato)，观察它们对该模型心肌组织中炎症细胞浸润程度、炎症因子、NF-κB/IκB通路、TGF-β1/Smad通路及胶原代谢的影响。 第一部分阿托伐他汀、罗格列酮及二者联合对2型糖尿病大鼠心肌的保护作用 目的：了解阿托伐他汀和罗格列酮是否对2型糖尿病大鼠心肌胶原堆积产生影响，探讨阿托伐他汀、罗格列酮及二者联合是否对2型糖尿病大鼠心肌有保护作用。 方法：用成年SD大鼠，通过高糖，高脂饮食加腹腔注射小剂量STZ的方法，制成2型糖尿病大鼠模型。采用光镜、电镜观察对照组、糖尿病组大鼠心脏的形态学改变以确定模型建立情况及炎症细胞浸润程度，用Masson三色染色观察心肌胶原沉积情况，生化法检测心肌羟脯氨酸含量以确定心肌胶原蛋白含量。用Western blot技术检测大鼠心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表达，用RT-PCR检测MMP-2、MMP-9、TIMP-1mRNA水平，用免疫组化法检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原及MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表达和组织定位。 12w时开始分成阿托伐他汀(20mg/kg/d)组、罗格列酮(2mg/kg/d)组及阿托伐他汀加罗格列酮组，用上述药物给大鼠每天一次灌胃至实验结束(干预12w)，观察药物对上述指标的变化。 结论：阿托伐他汀及罗格列酮可减轻糖尿病大鼠心肌组织炎症细胞浸润和胶原沉积，改善糖尿病大鼠心肌MMPs/TIMPs平衡，减轻糖尿病心肌病变的严重程度。阿托伐他汀联合罗格列酮可提高抗炎、抗纤维化程度。 第二部分炎症因子与2型糖尿病大鼠心肌胶原代谢的关系及阿托伐他汀、罗格列酮干预研究 目的：观察实验性2型糖尿病大鼠心肌胶原的积聚情况与血浆、心肌TNF-α、IL-6、脂联素、CRP和Ang Ⅱ、Aid的变化及其关系，了解阿托伐他汀、罗格列酮对它们的影响。 方法：采用放免法检测血浆和心肌局部TNF-α、IL-6及Ang Ⅱ、Ald的含量；应用ELISA法检测血浆和心肌中脂联素、hs-CRP的含量。 结果： 1.症状、体征、生化指标的改变：HE染色结果；超微结构的改变；Masson染色结果；心肌组织羟脯氨酸含量：均同第一部分。 2.DM大鼠血浆、心肌hs-CRP、TNF-α、IL-6及Ang Ⅱ、Ald的含量明显高于对照组大鼠(p<0.001)，罗格列酮及阿托伐他汀治疗组血浆、心肌 hs-CRP、TNF-α、IL-6及Ang Ⅱ、Ald的含量较同期。DM大鼠均显著下降(p<0.01)，且双药组较单药组降低更明显(p<0.01)；DM大鼠血浆、心肌Adi含量明显低于对照组大鼠(p<0.001)，罗格列酮及阿托伐他汀治疗组血浆、心肌脂联素含量较同期DM大鼠均显著升高(p<0.01)，且双药组较单药组升高更明显(p<0.01)。 3.心肌胶原含量与CRP、TNF-α、IL-6、脂联素、Ang Ⅱ、Ald相关分析表明：心肌局部CRP、TNF-α、Ang Ⅱ、Ald、IL-6含量与心肌胶原面密度(r=0.623、0.679、0.622、0.684，p<0.01；0.535，p<0.05)呈正相关，脂联素与胶原面密度(r=-0.562，p<0.05)呈负相关。 结论：DM大鼠无论血浆中还是心肌组织中致炎因子CRP、IL-6、TNF-α增多，抗炎因子脂联素减少，表明炎症参与了DM心肌病变的发生与发展。DM大鼠心肌组织局部AngⅡ、Ald明显增高，表明心肌中RAAS激活参与了DM心肌病变的发生与发展。阿托伐他汀和罗格列酮可通过抑制炎症因子及RAAS激活，增加抗炎因子，使糖尿病大鼠心肌组织胶原沉积和纤维化程度明显减轻，延缓糖尿病心肌病变的进程。阿托伐他汀联合罗格列酮可提高抗炎、抗纤维化程度。 第三部分阿托伐他汀、罗格列酮及二者联合对2型糖尿病大鼠心肌NF-κB/IκB信号转导通路的影响 目的：了解NF-κB/IκB通路在糖尿病大鼠心肌中的表达及阿托伐他汀、罗格列酮对它的干预作用。 方法：用Western blot技术检测大鼠心肌TNF-α、NF-κB亚单位P65、阻抑物IκBa蛋白的表达，用RT-PCR检测NF-κB、TNF-α mRNA水平，用免疫组化法检测上述蛋白表达和组织定位。 结论：NF-κB/IκB通路在糖尿病大鼠心肌中被激活，从而参与糖尿病心肌病变的发病。阿托伐他汀和罗格列酮可通过抑制糖尿病大鼠心肌NF-κB/IκB信号转导通路的激活，减轻糖尿病大鼠心肌组织胶原沉积和纤维化程度，从而延缓糖尿病心肌病变的进展。两药联合应用对NF-κB/IκB通路的干预作用具有叠加效应。 第四部分TGF-β1/Smad信号转导通路在2型糖尿病大鼠心肌病变中的表达及阿托伐他汀、罗格列酮干预研究 目的：观察2型DM大鼠心肌纤维化形成过程中TGF-β1/Smad信号通路的变化及阿托伐他汀、罗格列酮对它的干预作用。 方法：用RT-PCR检测TGF-β1、c-fos mRNA表达，用Western blot技术检测大鼠心肌TGF-β1、Smad2/3、Smad7、c-fos的表达，用免疫组化法检测上述蛋白表达及组织定位。 结果： 1.症状、体征、生化指标的改变：HE染色结果；超微结构的改变；Masson染色结果；心肌组织羟脯氨酸含量：均同第一部分。 2.阿托伐他汀、罗格列酮及二者联合对2型DM大鼠心肌组织TGF-β1、c-fos mRNA表达的影响：糖尿病组大鼠心肌组织中TGF-β1、c-fos mRNA表达水平较对照组明显增加(p<0.01)，阿托伐他汀和罗格列酮干预组较糖尿病组TGF-β1、c-fosmRNA表达水平明显减低(p<0.01)，两种药物干预组相比，无统计学差异，但双药组较单药组降低更明显(p<0.01)。 3.阿托伐他汀、罗格列酮及二者联合对2型DM大鼠心肌组织TGF-β1蛋白表达的影响：免疫组化显示：TGF-β1在对照大鼠成纤维细胞、血管内皮细胞和心肌细胞均有表达，但DM大鼠阳性染色光密度值明显高于同期对照大鼠的光密度值(p<0.01)，阿托伐他汀和罗格列酮干预后TGF-β1蛋白水平明显下降(p<0.01)，两种药物干预组相比，无统计学差异，但双药组较单药组降低更明显(p<0.01)。用Western Blot检测也得到相同结果。 4.阿托伐他汀、罗格列酮及二者联合对2型DM大鼠心肌组织Smad2/3蛋白表达的影响：免疫组化显示：Smad2/3在DM大鼠心肌中的表达明显升高(p<0.01)，阿托伐他汀和罗格列酮干预后Smad2/3蛋白水平明显下降(p<0.01)，两种药物干预组相比，无统计学差异，但双药组较单药组降低更明显(p<0.01)。 Western Blot结果显示：DM大鼠心肌Smad2/3蛋白水平与同期正常对照大鼠比较明显升高(p<0.01)，药物干预后Smad2/3蛋白水平明显下降(p<0.01)，且双药组较单药组降低更明显(p<0.01)。 5.阿托伐他汀、罗格列酮及二者联合对2型DM大鼠心肌组织Smad7蛋白表达的影响：免疫组化显示：Smad7在DM大鼠心肌中的表达明显降低(p<0.01)，阿托伐他汀和罗格列酮干预后Smad7蛋白水平明显升高(p<0.01)，两种药物干预组相比，无统计学差异，但双药组较单药组升高更明显(p<0.01)。用Western Blot检测也得到相同结果。 6.阿托伐他汀、罗格列酮及二者联合对2型DM大鼠心肌组织c-fos蛋白表达的影响：免疫组化显示：c-fos在DM大鼠心肌中的表达明显升高(p<0.01)，阿托伐他汀和罗格列酮干预后c-fos蛋白水平明显下降(p<0.01)，两种药物干预组相比，无统计学差异，但双药组较单药组降低更明显(p<0.01)。 Western Blot结果显示：DM大鼠心肌c-fos蛋白水平与同期正常对照大鼠比较明显升高(p<0.01)，药物干预后c-fos蛋白水平明显下降(p<0.01)，且双药组较单药组降低更明显(p<0.01)。 7.心肌胶原纤维的含量与TGF-β1、c-fos的关系：以胶原面密度为因变量，TGF-β1、c-fos(Western灰度积分光密度值)为自变量，进行直线相关分析，显示心肌胶原含量与TGF-β1、c-fos表达呈正相关，相关系数为0.542；0.507(p<0.05)。 8.c-fos与NF-κB、TGF-β1的相关性分析：以c-fos(Western灰度积分光密度值)为因变量，NF-κB、TGF-β1为自变量，进行直线相关分析，显示c-fos与NF-κB、TGF-β1均呈正相关，相关系数分别为0.955；0.924，(p<0.01)。 结论：DM大鼠心肌组织TGF-β1及Smad2/3的mRNA和蛋白表达明显增高，说明糖尿病心肌病的病理改变与TGF-β1系统启动有关。阿托伐他汀和罗格列酮可抑制糖尿病大鼠心肌TGF-β1/Smad通路。阿托伐他汀和罗格列酮可下调糖尿病大鼠心肌c-fos mRNA和蛋白水平。

目录

论文说明：英文缩写

声明

摘要

引言

第一部分阿托伐他汀、罗格列酮及二者联合应用对2型糖尿病大鼠心肌的保护作用

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第二部分炎症因子与2型糖尿病大鼠心肌胶原代谢的关系及阿托伐他汀、罗格列酮干预研究

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第三部分阿托伐他汀、罗格列酮及二者联合对2型糖尿病大鼠心肌NF-κB／IκB信号转导通路的影响

前言

材料与方法

结果

附表、附图

讨论

小结

参考文献

第四部分TGF-β1／Smad信号转导通路在2型糖尿病大鼠心肌病变中的表达及阿托伐他汀、罗格列酮干预研究

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

结语

综述 他汀类调脂药物与心肌纤维化

致谢

个人简历