阿托伐他汀、罗格列酮联合应用对2型糖尿病大鼠肾组织中TGF-β1等细胞因子表达的影响

摘要

目的：观察阿托伐他汀、罗格列酮及阿托伐他汀、罗格列酮联合应用对糖尿病大鼠肾组织FGF-β1、TIMP-1、MMP-2、MMP-9及c-fos的mRNA及蛋白的表达水平；探讨其与肾组织微结构改变和肾功能变化的关系及阿托伐他汀与罗格列酮联合应用对糖尿病大鼠肾脏保护作用的优势及其可能机制。
　　 方法：
　　 1.实验动物分组。
　　 75只雄性SD大鼠随机分为正常对照组（A组）、糖尿病组（B组）、阿托伐他汀干预糖尿病组（C组）、罗格列酮干预糖尿病组（D组）及罗格列酮+阿托伐他汀联合干预糖尿病组（E组），每组15只。实验结束时，糖尿病组：死亡5只，阿托伐他汀干预组：死亡2只，罗格列酮干预组：死亡1只，联合干预组：死亡0只。
　　 2.研究方法及观察指标。
　　 血糖采用美国强生Surestep血糖仪测定；血脂采用Humalyzer 2000半自动生化分析仪按常规测定。血管紧张素Ⅱ、血肌酐采用均相竞争放射免疫分析法。代谢笼收集记录24h尿量，-20℃保存，供考马斯亮蓝法测定尿蛋白。采用RT-PCR方法检测各组大鼠肾脏组织中TGF-β1、TIMP-1、MMP-2、MMP-9、c-fos的mRNA表达水平，免疫组织化学染色法检测上述细胞因子蛋白表达，Masson染色观察肾脏组织胶原代谢的改变，HE染色观察肾脏组织形态学变化。
　　 结果：
　　 1.糖尿病大鼠肾脏改变及药物干预影响。
　　 实验过程中正常对照组大鼠饮食水、生长正常，动作自如，反应灵敏，皮毛有光泽。糖尿病大鼠均表现为多饮、多尿、多食、皮毛粗躁、反应迟钝、活动减少等症状，每天需换垫料一两次。糖尿病组大鼠的血肌酐、24h尿蛋白及右肾重/体重比明显高于正常对照组147.20±1.91 vs 54.89±1.03；0.0446±0.0010 vs 0.0165±0.0005；0.0088±0.0003 vs 0.0039±0.0006（P<0.01）。阿托伐他汀、罗格列酮、罗格列酮+阿托伐他汀联合干预12周后与糖尿病组相比，血肌酐水平分别为：94.78±6.13、86.89±3.05、72.44±2.15；24h尿蛋白分别为：0.0356±0.0009、0.0300±0.0003、0.0264±0.006；右肾重/体重比分别为：0.0049±0.003、0.0046±0.003、0.0042±0.003，与糖尿病大鼠相比均有改善（P<0.05），尤以罗格列酮+阿托伐他汀联合干预降低最为显著（P<0.01）。
　　 2.生化指标的改变。
　　 糖尿病组：血糖、甘油三酯、总胆固醇及血管紧张素Ⅱ水平均明显均明显高于正常对照组，分别为20.16±2.35 vs5.57±0.87、2.94±0.16 vs 0.80±0.19、4.59±0.69 vs 1.18±0.50及1803.39±144.20 vs 67.70±15.27（P<0.01）。糖尿病模型大鼠经3种不同的干预治疗12周后，阿托伐他汀干预组甘油三酯及总胆固醇水平为：1.76±0.31、3.10±0.30，较糖尿病组明显下降（P<0.01）；罗格列酮干预组血糖、血管紧张素Ⅱ水平为：12.81±0.72、724.27±57.18，与糖尿病组相比显著降低（P<0.01）；联合干预组血糖、甘油三酯、总胆固醇及血管紧张素Ⅱ均显著改善：10.48±1.78、1.31±0.31、2.49±0.32、320.67±33.90（P<0.01）。
　　 3.病理学改变。
　　 HE染色切片高倍镜（×400）下显示：正常对照组肾小球及小管间质未见明显的病理改变。DM模型组大鼠12w时肾小球体积增大，部分近端肾小管上皮细胞呈空泡样变性，肾小球系膜区扩大、系膜增多，系膜细胞增生，基质明显增多，肾小球基底膜增厚，毛细血管狭窄甚至闭塞，小管间质散在炎性细胞浸润，说明模型已出现DN的典型肾脏损害病理改变。罗格列酮+阿托伐他汀联合干预组可见上述病理改变有明显减轻，而在罗格列酮组、阿托伐他汀组亦可见上述病理改变有不同程度减轻。
　　 4.各组大鼠肾脏组织胶原代谢的改变。
　　 Masson染色可见正常对照组大鼠肾小球毛细血管基底膜有少量胶原纤维，胶原面密度为0.0123±0.0006。与正常对照组相比，糖尿病大鼠肾小球毛细血管基底膜及肾间质胶原纤维增多，排列紊乱，胶原面密度为0.2672±0.0081，明显高于对照组（p<0.01）。罗格列酮+阿托伐他汀联合干预组肾组织着色明显浅淡稀疏，肾小球毛细血管基底膜及肾间质周围胶原纤维，积聚明显减轻，排列趋于规则，胶原面密度为0.0448±0.0005，明显低于糖尿病组（p<0.01）。阿托伐他汀组及罗格列酮组胶原面密度分别为0.0956±0.0026，0.0907±0.0044，较糖尿病组大鼠胶原纤维积聚有不同程度减轻，排列明显趋于规则。但两组间未有明显统计学差异（P>0.05）。
　　 5.TGF-β1、c-fos、TIMP-1、MMP-2及MMP-9的基因与蛋白表达。
　　 5.1 TGF-β1：
　　 5.1.1 免疫组化显示：阿托伐他汀、罗格列酮、罗格列酮+阿托伐他汀联合干预12周后与糖尿病组相比，TGF-β1蛋白水平：0.1254±0.0032、0.1345±0.0039、0.0992±0.0067，表达量呈下降趋势，其中以罗格列酮+阿托伐他汀联合干预组明显降低（p<0.01）。而在罗格列酮和阿托伐他汀两组之间未有明显差别，无统计学意义（p>0.05）。
　　 5.1.2 基因表达显示：以罗格列酮+阿托伐他汀联合干预最为显著，罗格列酮和阿托伐他汀两组之间未有明显差别，无统计学意义（p>0.05）。
　　 5.2 c-fos：
　　 5.2.1 免疫组化显示：以罗格列酮+阿托伐他汀联合干预组明显降低（p<0.01）。而在罗格列酮和阿托伐他汀两组之间未有明显差别，无统计学意义（p>0.05）。
　　 5.2.2 基因表达显示：以罗格列酮+阿托伐他汀联合干预组明显降低（p<0.01）。而在罗格列酮和阿托伐他汀两组之间未有明显差别，无统计学意义（p>0.05）。
　　 5.3 TIMP-1：
　　 5.3.1 免疫组化显示：以罗格列酮+阿托伐他汀联合干预组明显降低（p<0.01）。而在罗格列酮和阿托伐他汀两组之间未有明显差别，无统计学意义（p>0.05）。
　　 5.3.2 基因表达显示：以罗格列酮+阿托伐他汀联合干预组明显降低（p<0.01）。而在罗格列酮和阿托伐他汀两组之间未有明显差别，无统计学意义（p>0.05）。
　　 5.4 MMP-2：
　　 5.4.1 免疫组化显示：阿托伐他汀、罗格列酮、罗格列酮+阿托伐他汀联合干预12周后与糖尿病组相比：MMP-2表达较DM组呈恢复性上调：0.0922±0.0053、0.0816±0.0049、0.1005±0.0055（p<0.01）。而在罗格列酮和阿托伐他汀两组之间未有明显差别，无统计学意义（p>0.05）。
　　 5.4.2 基因表达显示：以罗格列酮+阿托伐他汀联合干预组最为明显（p<0.01）。而在罗格列酮和阿托伐他汀两组之间未有明显差别，无统计学意义（p>0.05）。
　　 5.5 MMP-9：
　　 5.5.1 免疫组化显示：以罗格列酮+阿托伐他汀联合干预组最为明显（p<0.01）。而在罗格列酮和阿托伐他汀两组之间相比，无统计学差异（p>0.05）。
　　 5.5.2 基因表达显示：以罗格列酮+阿托伐他汀联合干预组最为明显（p<0.01）。而在罗格列酮和阿托伐他汀两组之间未有明显差别，无统计学意义（p>0.05）。
　　 6 相关分析：
　　 以肾脏组织胶原密度含量为因变量，Crea、TGF-β1、TIMP-1、c-fos、MMP-2、MMP-9为自变量，进行直线相关性分析，显示肾脏组织胶原密度含量与Crea呈正相关，相关系数为r=0.98（p<0.01）；与TGF-β1、TIMP-1、c-fos、MMP-9呈正相关，相关系数分别为r=0.89；r=0.86；r=0.88；F0.82（p<0.01）；与MMP-2呈负相关，相关系数为r=-0.89（p<0.01）。
　　 结论：
　　 1.糖尿病肾病时，TGF-β1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、c-fos等炎性细胞因子的表达异常，在肾小球病变进展中具有重要作用。
　　 2.罗格列酮+阿托伐他汀联合干预治疗可通过对TGF-β1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、c-fos等细胞因子表达的调节，延缓DN发生发展的病理进程，实现其肾脏保护作用。联合干预治疗相对于罗格列酮、阿托伐他汀单一干预更为优越。

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结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 糖尿病肾病发生、发展机制及他汀类、TZDs类药物可能的肾脏保护作用机制

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