大鼠卵巢组织玻璃化冷冻及自体移植的实验研究

摘要

随着肿瘤综合治疗的进步，年轻女性肿瘤患者的生存率得到了很大提高。但在治疗癌症的同时，也带来了许多副作用，如卵巢早衰、正常卵巢的切除，丧失内分泌及生育能力等等。由于部分患者处于生育年龄，如何保存生育能力成为亟待解决的问题。
　　目前有三种方法来保存患者的生育能力：即胚胎冷冻，卵母细胞冷冻及卵巢组织冷冻。胚胎冷冻的只适用于已婚女性，而卵母细胞冷冻可用于单身女性，但妊娠率很低。而且这两种技术操作过程复杂，且需长时间促排卵及取卵，另外使用促排卵药物会使血清雌激素水平升高，禁用与一些雌激素敏感性恶性肿瘤患者。而卵巢组织冷冻是未成年人及未婚女性的唯一选择，因为这一方法不需要配偶，亦不需要促排卵药物，可以在任何周期取材，尤其适合需要及时治疗的肿瘤患者。
　　卵巢组织冷冻保存有三种方式：慢速程序化冷冻、常规玻璃化冷冻(conventional vitrification，CV)及直接覆盖玻璃化冷冻法(direct covervitrification，DCV)。尽管慢速程序化冷冻卵巢组织取得了很大进展，但其操作过程复杂，需要程序冷冻仪，费用高。而常规玻璃化冷冻较之更为简单、经济，冷冻效率更高，因而更为普遍。中国台北Chen等报道的直接覆盖玻璃化冷冻法，将小鼠卵巢组织与液氮直接接触，进行冷冻保存，该法降温速率可达15000℃/min，冷冻效果优于其他常规的玻璃化冷冻方法。但该方法目前研究尚少，也没有展开应用。
　　冷冻保存卵巢组织的目的为将卵巢组织移植回体内，一定程度上恢复冻融卵巢组织的内分泌及生育功能。然而在移植过程中，新生毛细血管形成前，会造成缺血再灌注损伤从而丢失大量卵泡。基于这些，有人提出不同的策略以优化移植结局，如移植较小的组织块，或在移植前使用FSH、维生素E和VEGF来预处理动物等，来提高移植物的生存率。
　　尽管卵巢组织的冷冻及移植已取得了一定的进展，关于移植冻融卵巢组织目前国内报道尚少见，也存在很多问题亟待解决：①寻求最佳冷冻方案以减少冷冻及复苏造成的损伤；②如何优化移植方案，减少缺血-再灌注损伤，为移植的卵巢组织的生长提供良好条件；③探讨接受移植物功能恢复的时间及维持的时间；④探讨卵巢癌患者自体移植卵巢组织的安全性；⑤移植的卵巢组织中卵子的发育及受精能力的探讨；⑥接受卵巢组织移植的患者的社会心理因素以及对生活质量的影响，等等。若这些问题能够一一解决，冷冻移植卵巢组织技术将能够广泛应用于保存肿瘤患者的生殖及内分泌功能，以提高女性患者的生活质量。
　　本研究以雌性性成熟Wistar大鼠作为研究对象，比较常规玻璃化冷冻方法及直接覆盖玻璃化冷冻方法对卵巢组织的影响，同时观察FSH和VEGF在移植冻融卵巢组织过程中的作用，以期为优化人类卵巢组织冷冻和移植提供实验依据。
　　第一部分、大鼠卵巢组织两种玻璃化冷冻保存方案的比较研究
　　目的：本研究比较直接覆盖玻璃化冷冻方法及常规玻璃化冷冻方法对大鼠卵巢组织的冷冻保存效果。
　　方法：将30只性成熟的Wistar大鼠随机分为3组，每组10只：A组--新鲜对照组，B组--常规玻璃化冷冻组(conventional vitrification，CV)，C组--直接覆盖玻璃化冷冻组(direct cover vitrification，DCV)。将各组大鼠双侧卵巢切除。B组，C组分别使用CV和DCV的方法冷冻保存。卵巢组织经HE染色后，于光镜下观察新鲜及冷冻复苏后原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡的形态，并计算每个切片中形态正常的各级卵泡的百分比，各级形态正常卵泡的百分比=(各级形态正常的卵泡个数/各级卵泡总个数)×100％。为避免重复计数，卵泡计数以卵母细胞核为标记。并用TUNEL法检测各组卵巢组织中卵泡的凋亡率，卵母细胞核呈阳性或超过50％的颗粒细胞为阳性即判断该卵泡凋亡。每个切片随机抽取10个视野，计数卵泡数(包括各级卵泡)。TUNEL阳性率=(卵泡凋亡个数/卵泡总个数)×100％。
　　结果：
　　(1)新鲜组、CV组和DCV组中的正常形态原始卵泡的比例分别为93.61±1.66％，46.86±4.56％和90.93±1.84％；初级卵泡为89.14±2.62％，33.39±3.06％和73.17±4.53％；次级卵泡为：84.03±4.07％，25.31±4.57％和62。09±3.59％。CV组中各级卵泡的正常率均较新鲜组低(P<0.05)，而DCV组中形态正常的原始卵泡的比例与新鲜组间差异无统计学意义(P>0.05)。各组卵巢组织中正常形态卵泡的比例从原始卵泡、初级卵泡到次级卵泡呈递减的趋势。
　　(2)新鲜组、CV组和DCV组中TUNEL表达阳性的所有卵泡比例分别为8.54±1.17％，40.31±3.87％，18.28±2.48％。与新鲜组相比经两种冷冻方式复苏后的卵巢组织凋亡的卵泡均有增加(P<0.05)，CV组中的凋亡率较DCV组更高，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：直接覆盖玻璃化冷冻法(DCV)比常规玻璃化冷冻法(CV)冷冻效率更高，可以有效的保存大鼠卵巢组织中的原始卵泡。
　　第二部分、大鼠卵巢组织自体移植的实验研究
　　目的：建立大鼠卵巢组织自体移植模型，观察新鲜卵巢组织和经DCV冷冻复苏后的卵巢组织经异位移植后及移植后应用FSH及VEGF，移植物的生长情况，分析应用FSH和VEGF对移植冻融大鼠卵巢组织的作用，为冻融的人类卵巢组织的移植提供实验依据。
　　方法：
　　(1)将40只性成熟的Wistar大鼠随机分为5组，A、B、C组各10只，D、E组各5只。A组为新鲜移植组，将卵巢组织切除后，将皮质切为约2mm*2mm*4mm大小的小块，立即移植于大鼠下肢肌肉中；B组卵巢组织经DCV冷冻保存2周后，复苏，自体异位移植于大鼠下肢内侧肌肉中，移植方法同上。C组，冻融方法同B组，于移植冻融的卵巢组织前2天开始每日注射FSH，5mIU/d；VEGF，20ng/d，术后继续注射FSH，5mIU/d；VEGF，20ng/d，前后共7天；并设D组(去势组)；E组(假手术组)为对照组。
　　(2)移植6周后，经眼眶取血，用Elisa法检测大鼠血清E2水平。
　　(3)取血后，断头法处死大鼠，收集卵巢组织，通过组织形态学观察卵泡的形态及卵泡密度。随机选取5个视野，在100倍视野下，用5mm×5mm网格微尺计数，计算每平方毫米内卵泡的数量，即卵泡密度。
　　(4)检测卵巢组织的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)。当核出现棕色时，视为PCNA蛋白表达阳性，每个标本取3张切片，每张切片随机取10个视野，计数阳性卵泡的数量，计算PCNA蛋白表达率，PCNA阳性卵泡率=(PCNA阳性卵泡个数/卵泡总个数)×100％。
　　(5)取出子宫称重。
　　结果：
　　(1)A、B、C、D、E组血清E2水平分别为59.61±6.85ng/L，28.38±8.47ng/L，58.99±8.63ng/L和2.59±1.19ng/L，79.56±12.07ng/L。A、B、C、E组的E2水平明显高于D组，差异有统计学意义(P<0.05)；A、B、C、D组E2水平低于E组，差异有统计学意义(P<0.05)；A、C组差异无统计学意义(P>0.05)；而C组E2水平高于B组，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　(2)A、B、C、E组卵巢组织卵泡的密度分别为5.17±0.47n/mm3，2.07±0。28n/mm3，5.05±0.31n/mm3，7.75±0.38n/mm3。A、B、C组卵泡的密度低于E组，差异有统计学意义(P<0.05)，B组的卵泡密度低于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；A组与C组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
　　(3)冻融的卵巢组织移植回大鼠体内后，A、B、C组及E组(假手术组)中卵巢组织各级卵泡均可见到PCNA(增值细胞核抗原)阳性表达，A、B和C组的移植物中PCNA的阳性率均较E组假手术组低，差异有统计学意义(P<0.05)，B组阳性率低于A、C组，差异有统计学意义(P<0.05)，A组与C组差异无统计学意义(P>0.05)。
　　(4)A、B、C、D、E组子宫重量分别为1.39±0.09g，1.10±0.12g，1.36±0。10g，1.02±0.06g，1.45±0.05g。A，C组与E组差异无统计学意义(P>0.05)，B组大鼠的子宫重量低于E组，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：经DCV复苏后的大鼠卵巢组织经自体异位移植后，卵泡能存活并恢复内分泌功能，VEGF及FSH的应用有利于移植卵巢组织中卵泡的生长。