KCNQ钾通道开放剂抗癫痫作用研究

摘要

KCNQ型钾离子通道是电压依赖性钾离子通道家族中的重要成员(Kv7)目前已有5个亚型(KCNQ1～5)，其中KCNQ2和KCNQ3基因编码的钾离子通道是构成神经系统M通道主要成分，该通道基因突变或功能失调会引起惊厥、癫痫等疾病，目前KCNQ通道已经成为抗癫痫新药的筛选靶点，葛兰素史克与Valeant联合开发的Retigabine(RTG)是第一个治疗癫痫病的M通道开放剂。我们经过高通量筛选得到的吡唑并[1，5-a]嘧啶-7(4H)-酮类的化合物对KCNQ2/3通道有良好的开放活性(ED500.21μM)。本文将利用多种癫痫动物模型，从不同角度考察RTG及目标化合物的抗癫痫作用，建立起适合药物筛选的在体试验方法，利用生物信号遥控检测技术，记录不同模型动物脑电发作方式，并进行比较分析，为建立安全、有效的整体动物试验方法提供帮助。
　　 1、KCNQ通道开放剂对电刺激致惊试验动物模型的影响
　　 目的:利用电刺激致惊试验动物模型，比较KCNQ通道开放剂(Retigabine，QO-58lysine)治疗作用。
　　 方法:
　　 (1)最大电休克刺激试验(maximalelectroshockseizuremodel，MES):昆明小鼠40只，体重22-26g，随机分4组，每组10只，QO-58lysine分12.5、25mg/kg两个剂量组，阳性对照药Retigabine（RTG）25mg/kg，溶剂对照组给予15％PEG，以上各组均腹腔给药。QO-58注射后30min，RTG注射后15min[8]，用S48型药理生理实验多用仪，参数调整如下:频率50Hz，时间0.2s，电流25mA，波宽0.1s，每只动物刺激一次，在9:00-14:00之间完成测试，室温控制在20～25℃，测定药物抗强直性惊厥发作百分率（或最大电休克保护率）。另取53只动物灌胃给药，QO-58lysine设25、50mg/kg两个剂量，RTG为25mg/kg，分别于药后60min、40min，同样的刺激参数致惊，测定药物抗强直性惊厥发作百分率（或保护率）。
　　 (2)6Hz失神样癫痫刺激试验:昆明小鼠50只，体重22-26g，随机分5组，每组10只，QO-58lysine分12.5、25mg/kg两个剂量组，RTG组25mg/kg，阳性对照药左乙拉西坦60mg/kg，溶剂对照组给予15％PEG，以上各组给药容积为0.1ml/10g。QO-58lysine、溶剂和RTG腹腔给药后30min，左乙拉西坦灌胃后60min，电刺激方案采用6Hz失神样癫痫刺激法，具体参数如下:频率6Hz，时间3s，电流32mA，波宽0.2ms，其它条件同上，测定抗癫痫发作百分率。
　　 结果:
　　 (1)腹腔注射:小鼠最大电休克保护率，QO-58lysine小、大两个剂量组分别为10％、20％、RTG为90％。与溶剂组比较，QO-58lysine两组均无显著提高（P＞0.05），RTG有显著性提高(P＜0.01);灌胃给药:与溶剂组比较，QO-58lysine两剂量保护率均无显著提高(P＞0.05)，RTG组有显著性提高(P＜0.01);
　　 (2)6Hz精神运动癫痫，与溶剂组相比QO-58lysine和RTG均没有显著性提高（P＞0.05），而阳性对照组左乙拉西坦组保护率为100％，与溶剂对照组相比显著提高（P＜0.01）。
　　 结论:RTG无论经口还是注射给药对MES动物模型效果显著，QO-58lysine作用不明显。6Hz精神运动癫痫模型QO-58lysine、RTG均无效，提示该类化合物对6Hz刺激引发的精神运动性癫痫模型不敏感。
　　 2、KCNQ通道开放剂对戊四唑致癫痫大发作模型(metrazolmaximalseizuremodel，MMS)的影响
　　 目的:利用PTZ皮下注射或静脉注射制备急性大发作癫痫动物模型，观察KCNQ开放剂的抗癫痫作用。
　　 方法:
　　 (1)昆明小鼠60只，体重18-22g，随机分5组，每组12只，QO-58lysine分6.25、12.5、25mg/kg三个剂量组，RTG12.5mg/kg剂量组，生理盐水作溶剂对照，以上各组均腹腔单次注射给药，注射容积0.1ml/10g。给药30min后于颈背部皮下注射戊四唑(85mg/kg)造癫痫模型，记录出现全身阵挛性癫痫症状的时间，记为大发作阈值，超过30min记为不发作（不发作的比例为保护率）。另取60只小鼠，随机分5组，灌胃给药，QO-58lysine剂量为25、50、100mg/kg，RTG为25mg/kg，溶剂组给予15％PEG，给药1小时后同上法造模，计算保护率。
　　 (2)昆明小鼠80只，分为4组，每组20只。QO-58lysine分12.5、25mg/kg两个剂量组，RTG12.5mg/kg组，生理盐水作对照，以上各组均腹腔注射一次，给药容积0.1ml/10g，给药30min后，尾静脉以0.3ml/min的速度恒流输注1％PTZ，观察1～5级癫痫发作情况，并记录1、3、4级症状典型发作的潜伏期，并计算保护时长。
　　 结果:
　　 (1)腹腔注射给药，与溶媒组比较，QO-58lysine大剂量组和RTG组均可明显延长发作的阈值(P＜0.05，0.01)，QO-58lysine小、中、大和RTG组保护率分别为8.3％、25％、42％、50％，QO-58lysine中剂量和RTG均有显著性(P＜0.05，P＜0.01)。灌胃给药，与溶媒对照组比较，QO-58lysine中剂量与RTG组可显著性延长阈值(P＜0.05)，QO-58lysine小、大剂量均不明显。QO-58lysine小、中、大剂量和RTG保护率分别为25％、58％、25％、50％，与溶媒组比较，QO-58lysine中剂量和RTG组均有显著性（均为P＜0.01）;
　　 (2)尾静脉恒流输注PTZ，RTG可明显延迟动物发生前肢阵挛性强直的时间(P＜0.01)，QO-58lysine各剂量组均没有显著改善（P＞0.5）。
　　 结论:RTG对PTZ皮下注射或静脉输注所致癫痫模型有显著疗效。QO-58lyaine灌胃50mg/kg和腹腔注射12.5mg/kg给药对PTZ所致癫痫有效。
　　 3、KCNQ开放剂对PTZ慢性点燃模型的影响，及对TrkA和KCNQ2蛋白表达水平的影响
　　 目的:用PTZ反复注射制备慢性点燃癫痫动物模型，观察KCNQ通道开放剂的治疗作用及对TrkA和KCNQ2蛋白表达水平的影响。
　　 方法:SD大鼠，体重150-200g，选取5只作为空白对照组，其余动物按照每日腹腔注射30mg/kgPTZ造模，药后观察30min，记录发作级别，选取发作级别及点燃时间相近的模型大鼠28只，再随机分4组，模型对照组注射生理盐水，RTG5mg/kg组，QO-58lysine12.5mg/kg、25mg/kg组，药物治疗7天，PTZ点然30min内观察发作级别和发作持续时间，并对发作级别进行评分比较。并于末次给药后分离脑组织固定、包埋、切片，免疫组化观察KCNQ2及TrkA蛋白表达水平的变化。
　　 结果:PTZ按照30mg/kg剂量注射给药20天左右80％动物点燃成功，可诱发典型癫痫症状。与模型组动物比较，RTG治疗第4天可明显降低发作评分值（P＜0.05），有效率为100％;QO-58lysine12.5mg/kg从治疗第5天开始显效，第6天可明显降低发作评分(P＜0.05)，治疗有效率为75％;QO-58lysine25mg/kg治疗有效率为57.1％，存在较大差异性。免疫组化结果提示PTZ模型组较空白对照组TrkA表达明显增多，RTG可以显著降低其表达水平，QO-58lysine组动物TrkA表达水平个别比较低。同时，PTZ模型组较空白组KCNQ2表达水平下降，但RTG和QO-58lysine均没有显著影响。
　　 结论:PTZ点燃模型上两种药物均表现出一定的治疗作用，尤其是在控制发作症状和TrkA表达水平方面RTG作用表现的更明显。
　　 4、KCNQ开放剂对癫痫动物模型脑电图的影响
　　 目的:利用生物信号遥控检测技术观察不同致痫模型动物脑电图的变化，寻找有生物学统计意义的波形变化参数，为抗癫痫药物筛选提供客观检测方法。
　　 方法:SD大鼠若干，体重180-220g，脑部手术预埋植发射子，恢复一周记录正常脑电图，分别用戊四唑(PTZ)、毛果芸香碱(PILO)腹腔注射，海人藻酸（KA）脑室内注射，制备急性癫痫动物模型，观察抗癫痫药物（苯巴比妥钠、卡马西以平、RTG和QO-58lysine）干预治疗3天后脑电图的变化和其行为学特征。
　　 结果:
　　 (1)大鼠脑电图显示用PTZ造模前后有明显变化，癫痫发作时脑电图出现典型高尖棘波，阳性药苯巴比妥钠、卡马西以平及KCNQ通道开放剂RTG均可以使发作级别减轻，癫痫发作时间缩短，棘波个数减少，QO-58lysine个体差异性较大，各种抗癫痫药物的应用均使动物发作后功率谱增加的倍数降低，起到一定的保护作用。
　　 (2)KA模型成功后(57.1％)，出现振幅较高的单个慢波，模型成功后，动物发作较不稳定，轻者出现昂头、站立、全身甩动、前肢阵挛、动物无法维持平衡而身体侧偏:重者进一步发展为流涎，全身震颤而导致全身性强直，苯巴比妥钠及RTG对动物的癫痫发作的行为学表现稍有缓解，EEG恢复困难。
　　 (3)毛果芸香碱造模成功率较低(63.6％)，造模后EEG显著性改变，用药后EEG基本无变化。
　　 (4)动物脑电图不同于人类，人类主要以Q波为主要频段，而动物主要以δ，θ低频波为主要波段。PTZ，KA，PILO三种工具药造模后诱导的动物各频段波占比变化不同，但均使高频波比例增多。
　　 结论:EEG提示，PTZ，KA，PILO这三种模型的脑电波引发的频段变化不同，这可能与其造模机制不同所引发的癫痫症状不同有关。PTZ、KA和PILO三种常用的造模工具药物，在引起动物行为学变化的同是可辅以EEG观察，作为评价药物疗效的重要手段。
　　 5、QO-58lysine血液及脑内浓度分布的测量
　　 目的:采用高效液相的方法测定腹腔注射给药后血液及脑内QO-58lysine浓度，为药效学研究提供帮助。
　　 方法:SD大鼠22只，随机分为两组，每组11只，QO-58lysine12.5mg/kg、25mg/kg腹腔注射每日上下午各一次，连续3天，于末次给药后30min，眼静脉取血、断头后取全脑，高效液相法测定血液、海马周脑组织中QO-58lysine含量。
　　 结果:QO-58lysine小、大剂量组脑组织含量分别在0.02～0.09ug/100mg组织和0.01～0.23ug/100mg组织之间，大剂量时脑组织药物含量高低相差20多倍，血中分布浓度在1.4～43ug/ml及5.4～95ug/ml之间，提示QO-58lysine的吸收个体差异较大，脑内分布浓度较低。
　　 结论:QO-58lysine腹腔注射后血中浓度较高，脑内浓度较低，高浓度时脑内个体差异较大。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历