化浊解毒方中药血清对肝星状细胞ERK及PI3K/Akt信号通路的影响

摘要

目的:肝星状细胞(HSC)的激活与活化是肝纤维化发生的关键环节，细胞外基质(ECM)合成与降解失衡是肝纤维化形成的主要病理过程。肝纤维化是由于多种致病因素引起的肝细胞的损伤及肝组织的炎症反应，是各种慢性肝病发展成为肝硬化的病理基础。目前临床尚缺乏特效、无毒副作用的抗肝纤维化药物，而中医药以整体调节为出发点，以辨证论治为指导，在抗肝纤维化方面具有独特的疗效和优势。导师李佃贵教授以“浊毒”理论治疗多种原因引发的肝纤维化，认为浊毒内蕴、肝络瘀阻是肝纤维化的基本病机，采用“化浊、解毒、调肝”为组方原则，制定了化浊解毒方，并取得较好的疗效。本实验采用血清药理学方法，从细胞水平观察MMP13和TIMP1mRNA、ERK、PI3K及Akt蛋白的表达，探讨化浊解毒方大鼠含药血清对ECM及HSC活化相关的信号转导通路的作用，为化浊解毒方抗肝纤维化可能的作用机制提供实验依据。
　　 方法:选取清洁级雄性SD大鼠40只，体重（200±20）g。自适应喂养一周后，随机分为模型对照组（给予生理盐水）、阳性对照组（即复方鳖甲软肝片组）、化浊解毒方组（分为临床等效剂量和二倍等效剂量），各组等体积灌胃给予相应药物10天后，制备大鼠含药血清。以含药血清体外培养肝星状细胞并加入TGF-β1，培养48h;其中，每只模型对照组大鼠同时留取备份血清，培养原代的肝星状细胞48h，作为正常对照组。应用RT-PCR法检测HSC中MMP13及TIMP1mRNA的表达，Western-blot法检测p-ERK、PI3K及p-Akt蛋白的表达。
　　 结果:
　　 1、RT-PCR法检测HSC中MMP13及TIMP1mRNA的表达:
　　 1.1、MMP13mRNA的表达:与正常对照组比较，模型对照组、阳性对照组、化浊解毒方临床等效剂量及二倍等效剂量组中MMP13mRNA的表达均降低，差异有统计学意义(P＜0.05);与模型对照组比较，阳性对照组、化浊解毒方二倍剂量组均可促进MMP13mRNA的表达，差异有统计学意义(P＜0.05);化浊解毒方二倍等效剂量的促进作用优于临床等效剂量，两者之间差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 1.2、TIMP1mRNA的表达:与正常对照组比较，给予TGFβ-1干预的各受试组TIMP1mRNA的表达均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其余各组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。
　　 2、Western-blot法检测HSC中p-ERK、PI3K、p-Akt蛋白表达:
　　 2.1、p-ERK蛋白的表达:与正常对照组比较，模型对照组、阳性对照组、化浊解毒方临床等效剂量及二倍等效剂量组p-ERK蛋白表达升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。阳性对照组、化浊解毒方二倍等效剂量组p-ERK蛋白表达均低于模型对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。化浊解毒方二倍等效剂量组p-ERK蛋白表达低于阳性对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。化浊解毒方二倍等效剂量组p-ERK蛋白表达低于化浊解毒方临床等效剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　 2.2、PI3K蛋白的表达:模型对照组、阳性对照组、化浊解毒方临床等效剂量及二倍等效剂量组与正常对照组比较，PI3K蛋白表达均升高，差异有统计学意义(P＜0.05);与模型对照组比较，化浊解毒方二倍等效剂量组PI3K蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）;化浊解毒方二倍等效剂量与阳性对照组比较PI3K蛋白表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05);化浊解毒方二倍等效剂量组PI3K蛋白表达低于化浊解毒方临床等效剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.3、p-Akt蛋白的表达:与正常对照组比较，模型对照组p-Akt蛋白的表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05），化浊解毒方二倍等效剂量组p-Akt蛋白的表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）;阳性对照组、化浊解毒方临床等效剂量及二倍等效剂量组p-Akt蛋白表达均较模型对照组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中化浊解毒方二倍等效剂量组差异有显著性(P＜0.01);化浊解毒方二倍等效剂量与临床等效剂量比较，p-Akt蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1、化浊解毒方含药血清可通过改善HSC中受抑制的MMP13表达，促进ECM降解，进而改善ECM的沉积。
　　 2、化浊解毒方含药血清可能通过降低HSC中p-ERK、PI3K、p-Akt蛋白的表达，进而阻断ERK及PI3K/Akt信号转导通路，起到减轻HSC活化程度的作用。
　　 3、化浊解毒方改善肝纤维化的机制可能是通过改善ECM的沉积，减轻HSC活化程度来实现的。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 方法

3 统计学处理

结果

1 RT-PCR法检测NHSC中MMP13及TIMP1mRNA的表达

2 Western-blot法检测HSC中p-ERK、PI3K、p-Akt蛋白表达

附图

附表

讨论

1 浊毒理论与肝纤维化

2 化浊解毒方大鼠含药血清的MMP13及TIMP1mRNA表达

3 化浊解毒方大鼠含药血清P-ERK、PI3K及P-Akt的蛋白表达

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历