TL1A对慢性实验性结肠炎小鼠IL-9mRNA及蛋白水平的影响

摘要

炎性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种以腹泻、腹痛为主要临床症状的慢性非特异性肠道炎性疾病，具有反复发作，难以治愈的特点。溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)是IBD的主要类型。目前多认为是在基因易感的基础上与持续性肠道感染、环境及肠道免疫系统异常等多种因素相关。近年来IBD的整体发病率呈上升趋势，成为我国消化系统的常见病。然而，由于IBD的发病机制不明，迄今尚缺乏真正有效的防治手段。因此，深入研究IBD的发病过程中肠道免疫及分子调控网络，将为IBD防治提供理论依据。
　　长期以来，白介素(interleukin，IL)-9一直被认为是Th2类细胞产生的细胞因子，在自身免疫性疾病、过敏性疾病等发病过程中具有重要的生物学效应。然而近几年来随着辅助性T细胞重新分类，IL-9作为Th9独特性分泌因子被人们重新重视。在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(experimental autoimmune encephal-omyelitis，EAE)模型中，特异性阻断IL-9会减慢疾病进展。在皮肤移植时，IL-9通过加强移植物中Foxp3+Treg细胞抑制作用，抑制宿主抗移植免疫应答。在B16黑色素瘤模型中，Th9细胞分泌IL-9诱导肿瘤组织分泌CC型趋化因子-20(chemokine C-C motifligand20，CCL20)，使抗原提呈细胞活化并提呈抗原，进一步激活的细胞毒性CD8+T淋巴细胞迁移并杀死瘤样变组织中的肿瘤细胞。IL-9还能介导Th2型免疫应答，在肺部超敏反应中发挥作用。IL-9协同IL-3引起肥大细胞脱颗粒并释放炎性介质，从而增加气道高反应性，在小鼠哮喘模型中，IL-9的特异性转录因子PU.1缺陷或PU.1和IL-25均缺陷的小鼠气道炎症减轻。在肠道内感染时，IL-9能诱导肥大细胞分泌转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)，进一步加重肠道炎症。IL-9广泛的生物学活性及双向调节作用使其日益受到人们的关注。
　　肿瘤坏死因子样配体1A(tumor necrosis factor-like ligand1 aberrance，TL1A)是肿瘤坏死因子超家族成员15(TNF superfamily member15，TNFSF15)基因的蛋白产物，主要表达在人类的内皮细胞，包括人脐静脉内皮细胞、成人皮肤微血管内皮细胞和子宫肌层内皮细胞等，其中以人脐静脉内皮细胞中表达最高。近来研究表明，TL1A在炎症组织中的巨噬细胞、固有层T淋巴细胞、单核细胞和树突细胞(dendric cell，DC)中也有表达。TL1A与其受体-肿瘤坏死因子受体超家族成员死亡受体3(deathreceptor3，DR3)结合，为T淋巴细胞的分化提供协同刺激信号，促进Th1和Th17细胞的极化及效应功能，从而影响机体免疫调节，在自身免疫性疾病和炎症性疾病的发生中发挥重要作用。目前对TL1A的研究表明，TL1A与IBD密切相关，FSF15基因诱导TL1A的表达促进了IBD的发生与进展，TNFSF15基因作为IBD的易感基因已得到证实。
　　Targan等进一步采用DSS慢性结肠炎模型和结肠炎基因Gαi2敲除的T细胞转移模型鼠进行研究，发现TL1A不仅可单独或协同IL-12和IL-23作用于Th1细胞分泌IFN(interferon，IFN)-α，同时还可作用于Th17细胞使其分泌IL-17增加。近来，Meylan F等对T细胞或DC过表达TL1A的转基因鼠进行研究也发现，TL1A过表达可诱发IL-13介导的自发性结肠炎，并使Th2介导的免疫反应明显升高。但其是否对IL-9蛋白及其mRNA水平的影响尚未见报道，本实验在于探索TL1A与IL-9的关系。
　　目的:探讨TL1A对右旋葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)诱导的慢性实验性结肠炎小鼠IL-9蛋白水平及mRNA水平的影响。
　　方法:
　　①L-Tg小鼠与C57BL/6 WT小鼠（体重15～18g，6-8周）分为Control/WT组、DSS/WT组、Control/Tg组、DSS/Tg组，每组6只。Control组持续饮用蒸馏水;DSS组间断饮用3％ DSS，时间段为分别为第1～5天、第8～12天、第15～19天、第22～26天、及第27、28天，其余时间饮用蒸馏水。第29天处死动物。
　　②每天观察小鼠精神状态、体重变化、活动情况、毛发光泽度、进食以及大便改变和便血情况等，评估疾病活动指数(disease activity index，DAI)。
　　③观察结肠形态学改变，记录结肠炎症程度并评分、并测量结肠长度。④应用苏木素伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色观察结肠组织病理学改变。⑤应用Real-time Q-PCR方法及Western blot技术检测结肠组织中IL-9的mRNA及蛋白的表达变化。⑥应用免疫组织化学方法分析IL-9在结肠组织中的表达部位。⑦提取脾脏的单个核细胞，并应用ELISA检测其上清液中IL-9的浓度。
　　结果:
　　①与Control组相比，DSS组小鼠体重显著下降，DSS/Tg组体重显著低于DSS/WT组;与Control组相比，DSS组DAI评分逐渐升高，DSS/Tg组小鼠毛发、精神状态差，DAI评分显著高于DSS/WT组。②与Control组相比，DSS组结肠明显充血、水肿，变形、僵硬，与肠周围组织粘连，结肠长度显著缩短，DSS/Tg组与DSS/WT组相比，结肠长度缩短。
　　②结肠组织病理学观察发现，Control组小鼠结肠黏膜完整，腺体排列整齐，无明显炎症细胞浸润及溃疡;DSS组结肠黏膜上皮出现不同程度的缺损或者脱落坏死，部分形成溃疡，隐窝消失，大量腺体破坏或者消失，固有层内大量炎性细胞浸润，基层水肿增厚，黏膜及黏膜下层水肿，大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润。与Control组相比，DSS组结肠病理组织评分显著升高，DSS/Tg组小鼠的结肠形态学评分及显微镜下结肠病理评分均显著高于DSS/WT组。
　　③结肠免疫组织化学结果显示，IL-9的表达部位主要定位于单个核细胞的胞浆中，表达IL-9的细胞主要是肠黏膜固有层单个核细胞及黏膜下层炎性浸润的淋巴细胞及肠组织淋巴小结中的淋巴细胞。
　　④Real-time Q-PCR检测结肠IL-9 mRNA结果显示，与Control组相比，DSS结肠组织中IL-9的mRNA的表达量显著增高(P＜0.05); DSS/Tg组显著高于DSS/WT组(P＜0.05）。
　　⑤应用Western blot技术检测结肠IL-9分别在Control/WT组、DSS/WT组、Control/Tg组、DSS/Tg组中的相对表达量，其结果显示:DSS组显著高于Control组(P＜0.05），DSS组之间也有显著性差异，与DSS/WT组相比，DSS/Tg组显著增高(P＜0.05）。
　　⑥应用ELISA技术检测血清中IL-9的表达水平，结果显示，与Control组相比，DSS组IL-9水平显著升高(P＜0.05);与DSS/WT组相比，DSS/Tg组血清IL-9水平显著增加(P＜0.05）。
　　⑦脾脏单个核细胞细胞提取数显示，Control组总数约为49×106个±8×106个，DSS组与之相比明显升高。ELISA检测细胞培养后上清液中IL-9的水平结果如下，与Control组相比，DSS组未刺激前IL-9的明显升高(P＜0.05）;刺激后与Control相比，DSS组IL-9的水平也明显升高(P＜0.01); DSS/Tg组相比于DSS/WT组显著增高(P＜0.05）。
　　结论:
　　①在慢性试验性溃疡性结肠炎模型中，小鼠IL-9的表达水平增高;TL1A能上调IL-9的表达水平;
　　②IL-9主要表达在肠黏膜固有层单个核细胞及黏膜下层淋巴细胞胞浆中。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 主要试剂的配置

3 试验方法

4 统计学方法

结果

1 转基因小鼠的鉴定

2 一般情况观察

3 小鼠体重及DAI评分变化

4 结肠大体形态学变化

5 结肠组织病理学变化

6 结肠免疫组织化学结果

7 结肠组织中IL-9 mRNA的表达水平

8 结肠组织中IL-9蛋白表达水平

9 血清IL-9水平变化

10 脾脏单个核细胞上清液中IL-9水平的测定

附图

讨论

结论

参考文献

综述 IL-9的研究新进展

致谢

个人简历