消癌平联合细胞周期特异性化疗药对lewis肺癌小鼠移植瘤生长的影响

摘要

目的:
　　肺癌是一种常见的恶性肿瘤，虽然目前以手术、放疗、化疗为主的综合疗法治疗肺癌取得了一定发展，但由于化疗药物耐药现象及其严重的毒副反应等，肺癌治疗的仍未能取得令人满意的效果，因此研究中药抑瘤作用机制具有重要的理论意义和应用价值，消癌平为中药通关藤的提取物，目前已广泛应用于临床，常用于肺癌和消化道肿瘤等。迄今国内学者对其作用机制进行了一系列的研究。但消癌平与细胞周期特异性药物联合应用研究甚少，本实验旨在研究消癌平对lewis肺癌小鼠移植瘤生长的影响及其与细胞周期特异性化疗药联合应用抗肿瘤效果，为消癌平应用于肺癌的临床治疗提供一些新的理论依据。
　　方法:
　　预实验:
　　(1)取对数增长期的lewis单细胞悬液（细胞浓度106个/ml）0.2ml皮下种植于C57BC/L小鼠腋下，数量共10只，后观察小鼠的生存的状态及小鼠成瘤时间。
　　(2)用上述方法再次复制Lewis肺癌小鼠模型，数量共30只，将上述小鼠随机分成2组，每组15只，于种植后第10天分别腹腔注射生理盐水0.2ml/只，消癌平注射液(0.2ml/只，40mg/ml)，分别于第12天、14天和第16天处死小鼠5只。将部分瘤组织剪碎，加入少量0.01mmoL/l磷酸盐缓冲液，用300目尼龙网过滤，将滤液离心，弃上清，PBS冲洗3次，每管加入1ml75％乙醇，边加边震荡，将单细胞固定后，于-20℃冻存，上机测定前复苏，离心去除乙醇，PBS冲洗2次，每管加入用生理盐水配制的含0.5％TritonⅩ-100、1％RNA酶，5％PI的混合溶液0.5ml，30min后用300日尼龙网过滤，取滤液，用流式细胞仪分析细胞周期。
　　实验:
　　(1)实验动物分组及给药:复制Lewis肺癌小鼠模型，数量共60只，将60只造模后的小鼠随机分成6组，每组10只，于种植后第10天开始给药，根据人鼠给药剂量换算公式计算给药剂量，其给药剂量及时间如下:
　　1组:生理盐水0.2ml/只（d10-d28腹腔注射）
　　2组:消癌平0.2ml/只，（消癌平注射液40mg/ml,d10-d28腹腔注射）
　　3组:氟尿嘧啶0.2ml/只（氟尿嘧啶3mg/ml d14、d18、d22、d25腹腔注射，其他时间用生理盐水，腹腔注射，至第28天）
　　4组:消癌平0.2ml/只（消癌平注射液40mg/ml，d10-d14腹腔注射），第14天开始用氟尿嘧啶，氟尿嘧啶0.2ml/只（氟尿嘧啶3mg/ml d14、d18、d22、d25腹腔注射，其他时间用消癌平，至第28天）
　　5组:丝裂霉素0.2ml/只（丝裂霉素0.04mg/ml d14、d18、d22、d25腹腔注射，其他时间用生理盐水，腹腔注射，至第28天）
　　6组:消癌平0.2ml/只（消癌平注射液40mg/ml，d10-d14腹腔注射），第14天开始用丝裂霉素，丝裂霉素0.2ml/只（丝裂霉素0.04mg/ml d14、d18、d22、d25，腹腔注射，其余时间用消癌平，至第28天）
　　(2)观察各组生长情况:每3-4天用游标卡尺测肿瘤长径(a)和垂直径(b)，肿瘤体积=ab2/2，绘制瘤体体积生长曲线，于第28天脱颈处死所有小鼠，并计算小鼠的肿瘤生长抑制率。
　　(3) VEGF免疫组化:肿瘤组织用福尔马林固定12h后，石蜡包埋待用，严格按说明书操作，测定血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达情况。蛋白表达的定量结果在高倍镜下(X400)计算阳性细胞阳性面积的百分比(％)，每张切片随机选取5个视野，求平均值。VEGF蛋白表达阳性判断标准A:染色强度:阴性0分，浅棕色1分，棕黄色2分，深棕黄色3分;B阳性细胞比例:1/3以下为1分，I/3～2/3为2分，2/3以上为3分，积分数=A×B，A×B=0为阴性，A X B=1～4分为弱阳性，A X B＞4分为强阳性，高表达。
　　(5)统计结果分析:所有数据均使用SPSS13.0 for Windows软件进行分析，以探讨消癌平的抑瘤机制及消癌平联合细胞周期特异性化疗药的抑瘤效果。
　　结果:
　　1、成瘤时间:复制Lewis肺癌细胞模型，小鼠于接种肿瘤后9天可触及粟粒大小结节。
　　2、细胞周期:第12天消癌平组G1期:0.3220±0.02950，生理盐水组G1期:0.3340±0.0336，两两比较P＞0.05，未见统计学差异，第14天消癌平组G1期:0.5540±0.04827，生理盐水组G1期:0.2900±0.03536，两两比较P＜0.05，第16天消癌平组G1期:0.5920±0.03701，生理盐水组G1期:0.2980±0.04324，两两比较P＜0.05，第12天消癌平组G1期:0.3220±0.02950和第14天消癌平组G1期:0.5540±0.04827，两两比较P＜0.05，第14天消癌平组G1期:0.5540±0.04827与第16天消癌平组G1期:0.5920±0.03701，两两比较P＞0.05，虽然第16天G1期较第14天G1期高，但两者比较无差异。
　　3、肿瘤体积:于种植后第9天后可触及粟粒大小的肿瘤结节，各组于第18天之前肿瘤体积未见明显变化，第18天后可见生理盐水组肿瘤体积大于各实验组，于第28天生理盐水组肿瘤体积大于各实验组，消癌平组大于其余各实验组，丝裂霉素组和消癌平联合丝裂霉素组未见统计学差异，氟尿嘧啶组和消癌平联合氟尿嘧啶组未见统计学差异。
　　4、肿瘤生长抑制率及瘤重:生理盐水组、消癌平组、氟尿嘧啶组，消癌平联合氟尿嘧啶组，丝裂霉素组、消癌平联合丝裂霉素组各组分别存活5只、7只、5只、5只、5只、7只，消癌平组、氟尿嘧啶组，消癌平联合氟尿嘧啶组，丝裂霉素组、消癌平联合丝裂霉素组各组抑制率分别为22.6％，60.8％，72.7％，37.4％，42.9％，生理盐水组瘤重9.72±0.47g，消癌平组瘤重7.52±0.39g，氟尿嘧啶组瘤重3.80±0.95g，消癌平联合氟尿嘧啶组瘤重2.65±0.79g，丝裂霉素组瘤重6.08±0.42g，消癌平联合丝裂霉素组5.54±0.41g，统计结果示:生理盐水组与各实验组可见统计学差异，消癌平组、丝裂霉素组、消癌平联合丝裂霉素组3组比较未见统计学差异，氟尿嘧啶组，消癌平联合氟尿嘧啶组2组比较未见统计学差异。
　　5、VEGF免疫组化:生理盐水组，消癌平组，氟尿嘧啶组，消癌平联合氟尿嘧啶组，丝裂霉素组，消癌平联合丝裂霉素组各组强阳性率分别为:80.0％，57.1％，40％，20％，40％，42.8％，各组经卡方检验未见统计学差异。
　　结论:
　　1、消癌平对Lewis小鼠移植瘤有显著抑制作用。
　　2、消癌平对G1期瘤体细胞有明显的阻断作用，使瘤体细胞主要停留在G1期，G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例明显减少。
　　3、消癌平联合G1期细胞周期特异性化疗药丝裂霉素能改善小鼠生存状态，降低小鼠死亡率。
　　4、消癌平联合G1期细胞周期特异性化疗药丝裂霉素抑瘤率高于单用丝裂霉素，据此推断消癌平联合G1期细胞周期特异性化疗药抑瘤效果强于单用G1期细胞周期特异性化疗药。
　　5、生理盐水组VEGF表达高于各试验组，氟尿嘧啶组，消癌平联合氟尿嘧啶两组VEGF表达低于其余各实验组。且消癌平联合S期细胞周期特异性化疗药氟尿嘧啶VEGF表达低于于单用氟尿嘧啶组，据此推断消癌平抗肿瘤方面与抑制肿瘤血管生成相关。

目录

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摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 消癌平抑制肿瘤研究进展

致谢

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