DNA氧化在2型糖尿病肾损伤中的作用研究

摘要

对于DN的具体发病机制，还不是很明确。T2DM和DN患者机体DNA的氧化水平如何？DNA的氧化损伤在T2DM肾损伤中的作用如何？饮食中添加DHA会对T2DM肾脏中DNA的氧化水平有何影响？能否有效地缓解T2DM所引起的肾组织损伤？DHA又是通过何种分子机制对T2DM肾脏DNA的氧化损伤造成影响的呢？
　　本文主要分三部分展开研究：
　　第一部分 DNA氧化损伤生物标记物8-OHdG毛细管电泳分析新方法的建立
　　目的:为下一步研究T2DM和DN患者机体的DNA氧化水平奠定方法学的基础。
　　方法:固相萃取结合胶束毛细管电泳紫外检测法。
　　结果:本研究建立了一种固相萃取结合胶束毛细管电泳检测尿液中8-OHdG的新方法。通过优化SPE萃取条件和MEKC分离条件，在最佳条件下，8-OHdG浓度在1到500μg L-1之间线性良好，LOD(S/N=3)为0.27μg L-1，LOQ(S/N=10)为0.82μg L-1。该方法检测尿液中8-OHdG的日间精密度和日内精密度的相对标准偏差分别为5.6％和4.3％，（健康儿童尿液加标）回收率在99.8％～103.2％之间。该方法弥补了CE-UV在测定痕量组分方面的不足。
　　结论:建立了一种简单，灵敏，快速的检测尿液中8-OHdG的新方法，为机体DNA氧化损伤水平的测量提供了一种新的途径。
　　第二部分 DNA氧化水平与2型糖尿病肾损伤之间相关性的研究
　　目的:探讨2型糖尿病患者肾损伤与DNA氧化的关系。
　　方法:1.应用第一部分新建的以及本室原有的毛细管电泳检测方法测定并分析CON组、T2DM组和DN组尿液中的8-OHdG和creatinine;2.对尿液中8-OHdG/creatinine比值与其他临床生化指标之间进行person相关性分析。
　　结果:DN组患者尿液中8-OHdG/creatinine（45.14±12.68μg/g）显著高于CON组（11.72±2.38μg/g）和T2DM组（16.37±4.97μg/g），尿液中8-OHdG/creatinine的水平与尿酸(UA)值无显著相关性，与糖化血红蛋白和24小时尿蛋白排泄量之间有显著正相关性。
　　结论:DN组患者肾损伤与DNA的氧化有关
　　第三部分 DHA通过降低DNA氧化水平缓解2型糖尿病大鼠的肾损伤
　　目的:探讨DHA是否可通过降低氧化应激及DNA的氧化来改善T2DM的肾损伤。
　　方法:1.高脂饮食加小剂量STZ诱导T2DM大鼠，并经饮食补充DHA;2.利用生物化学和病理学方法检测大鼠肾脏功能相关的生化指标和肾组织结构，评价DHA对肾脏功能的影响;3.利用组织荧光和生物化学方法，测定大鼠肾脏组织的ROS水平、脂质过氧化水平、DNA的氧化损伤，确定DHA能否改善T2DM肾脏组织的氧化应激，脂质过氧化以及DNA损伤;4.使用生物化学的方法检测大鼠肾脏组织的重要抗氧酶活性和重要的抗氧物质的含量，确定DHA对T2DM大鼠肾脏组织的抗氧化系统的影响;5.采用Real time PCR检测饮食添加DHA对T2DM大鼠肾脏三大抗氧化系统主要相关抗氧酶mRNA表达水平的影响;6.Western blot检测饮食添加DHA对T2DM大鼠肾脏组织中NADPH氧化酶重要亚基的蛋白表达水平的影响。
　　结果:1.DHA降低了T2DM大鼠24小时尿蛋白的排泄率
　　32周干预结束时，DM组大鼠的24小时尿蛋白排泄率(1893.9±948.8ng)显著高于对照组（477.5±197.1 ng）（P＜0.05）;而DHA组大鼠的24小时尿蛋白排泄率(1133.9±542.7 ng)明显低于DM组（P＜0.05），但显著高于CON组(P＜0.05)。
　　2.DHA改善了T2DM大鼠肾脏组织结构的损伤
　　H&E染色结果显示:CON组大鼠肾脏未见明显的肾组织病理学变化，肾小球边缘齐整，结构正常，分布较均匀，细胞核排列较为整齐，肾小管形态清晰。DM组大鼠肾小球分布不均匀，细胞核排布散乱，肾小管上皮细胞出现水肿，基质弥漫性增多，肾小球体积增大，平均肾小球截面积明显高于CON组。DHA组介于以上两者之间，较DM组有所改善。
　　3.DHA改善了T2DM大鼠肾脏组织的DNA损伤
　　3.1 DHA降低了T2DM大鼠肾小管内8-OHdG的含量
　　肾脏组织石蜡切片免疫荧光结果显示在肾小管内8-OHdG的含量DM组明显高于CON组和DHA组。说明饮食中添加DHA可有效减少T2DM大鼠肾脏肾小管内8-OHdG的生成。
　　3.2 DHA缓解了T2DM大鼠肾脏组织核DNA的凋亡。
　　DM组肾脏组织切片TUNEL染色显示凋亡的强度明显高于CON组和DHA组，说明饮食中添加DHA可有效缓解T2DM大鼠肾脏内的细胞凋亡。
　　4.DHA降低了2型糖尿病大鼠肾脏组织的氧化应激水平
　　4.1 DHA降低了2型糖尿病大鼠肾脏组织的ROS水平
　　DHE染色法和荧光分光光度检测法的检测结果一致显示:DM组大鼠肾脏组织中的ROS水平显著高于CON组（P＜0.05）;而DHA组大鼠肾脏组织中的ROS水平明显低于DM组（P＜0.05），而与CON组相比无统计学差异(P＞0.05)。
　　4.2 DHA降低了T2DM大鼠肾脏组织中NADPH氧化酶重要亚基在mRNA水平及蛋白水平上的表达
　　在高血糖条件下NADPH氧化酶可以诱导产生ROS。Real time PCR结果显示DHA可通过下调NADPH氧化酶的Nox2，Nox4和P22 phox亚基基因在mRNA水平上的表达来增强糖尿病大鼠肾脏组织的抗氧化能力。
　　Western Blot结果显示DHA可通过下调NADPH氧化酶的Nox2，Nox4，P22 phox和p-P47 phox亚基基因的蛋白表达水平来降低糖尿病大鼠肾脏组织的ROS水平。
　　5.DHA降低了T2DM大鼠肾脏组织脂质过氧化物的含量
　　5.1 DHA降低了T2DM大鼠肾脏组织脂质过氧化物MDA的含量
　　MDA是膜脂质过氧化的重要的产物之一，它的产生能加剧细胞膜系统的损伤程度。DM组肾脏组织匀浆液中MDA的含量为(1.20±0.18nmol/mg prot)明显高于CON组（0.86±0.13 nmol/mg prot）和DHA组（1.01±0.19 nmol/mg prot），说明饮食中添加DHA可有效减少T2DM大鼠肾脏内脂质过氧化物MDA的生成。
　　5.2 DHA降低了T2DM大鼠肾脏组织肾小管内4-HNE含量
　　在体内4-HNE是n-6系多不饱和脂肪酸过氧化的产物，大鼠肾小管内4-HNE的含量DM组显著高于CON组和DHA组;而肾小球内4-HNE的含量，DM组和DHA组均显著高于CON组，但DM组和DHA组之间没有统计学差异。这说明饮食中添加DHA能够有效抑制T2DM大鼠肾小管内的n-6系脂肪酸的过氧化。
　　6.DHA提高了T2DM大鼠肾脏组织的抗氧能力
　　6.1 DHA提高了T2DM大鼠肾脏组织的总抗氧能力(T-AOC)
　　DM组肾脏组织匀浆液中T-AOC(1.03±0.23 U/mg prot)明显低于CON组(1.39±0.41 U/mg prot)和DHA组(1.31±0.28 U/mg prot)，说明饮食中添加DHA可有效增加T2DM大鼠肾脏的总抗氧能力。
　　6.2 DHA提高了T2DM大鼠肾脏组织内谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶和硫氧还蛋白还原酶等抗氧酶的活性
　　实验检测了三组大鼠肾脏组织匀浆液中谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶、总超氧化物歧化酶和硫氧还蛋白还原酶等重要的抗氧酶的酶活性，结果显示饮食中添加DHA可有效增加T2DM大鼠肾脏内谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶和硫氧还蛋白还原酶的活性。
　　6.3 DHA增加了T2DM大鼠肾脏组织内谷胱甘肽的含量
　　结果显示，DM组肾脏组织匀浆液中GSH的含量(0.0062±0.0035μM/gTissue)明显低于CON组(0.0213±0.0049μM/g Tissue)和DHA组(0.0112±0.0037μM/g Tissue)，说明饮食中添加DHA可以有效增加T2DM大鼠肾脏内还原型谷胱甘肽的含量。
　　6.4 DHA增加了T2DM大鼠肾脏组织内4-HHE的含量
　　4-HHE是n-3系多不饱和脂肪酸（主要是DHA）过氧化的产物，实验结果显示4-HHE在肾小球和肾小管内的含量变化趋势一致，DHA组的4-HHE含量显著高于DM组和CON组。这说明DHA可以作为抗氧剂通过自身氧化来降低肾脏组织的氧化损伤。
　　7.DHA可以上调SOD1、Gpx1和Gpx4-1等基因在mRNA水平上的表达。
　　结论:1.DHA改善了T2DM大鼠的肾功能和肾组织损伤。
　　2.DHA通过增加抗氧酶的活性以及自身氧化从而降低了T2DM大鼠肾组织DNA的氧化损伤和氧化应激水平。
　　结论:1.T2DM的肾损伤与肾脏组织内DNA的氧化损伤相关。
　　2.DHA通过增加抗氧酶的活性以及通过自身氧化降低了T2DM大鼠肾组织的氧化应激水平和DNA的氧化损伤改善了肾功能和肾组织损伤。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 DNA氧化损伤生物标记物8-OHdG毛细管电泳分析新方法的建立

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 DNA氧化水平与2型糖尿病肾损伤之间相关性的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 DHA通过降低DNA氧化水平缓解2型糖尿病大鼠的肾损伤

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 衰老及其相关疾病研究中ROS和氧化损伤的检测方法研究进展

致谢

个人简历