MicroRNA-381靶向调控LRH-1对结肠癌细胞增殖和侵袭影响及机制的研究

摘要

结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，是在内、外因素作用下发生的多基因表达失调的一种个体化疾病，严重威胁着人类生命健康。虽然大量研究已经证实，饮食和遗传因素等在结肠癌的发生和发展中起着重要作用，但结肠癌恶性转化及肿瘤细胞增殖、侵袭的关键因素还有待进一步研究确定。
　　微小RNA（microRNAs，miRNA）是一类长度约19-22核苷酸的RNA，通过与靶基因 mRNA的3‘-UTR非编码区互补匹配来调控基因转录后表达。这种相互作用导致翻译阻遏，多数情况下降低 mRNA的表达水平。研究表明，多种miRNA在人肿瘤中表达下调或上调，包括结肠癌，这为肿瘤发生提供了新的分子基础。Tang等首先报道了 miR-381在神经胶质瘤细胞中的作用。结果表明，miR-381可促进神经胶质瘤细胞在体外和体内的增殖，此作用与减弱抑制 MEK/ERK和 AKT信号有关。然而， Rothschild等发现miR-381在肺腺癌中的表达显著下调，低miR-381表达水平与预后不良相关。此外，miR-381通过上调Cdc2的活性来增强5-FU在肾癌细胞中的化疗敏感性。miR-381表达的变化也与MDR1基因的表达和多种药物耐药性的发展呈负相关。这些结果表明，miR-381在癌细胞中的作用因肿瘤的不同而不同，因此，有必要研究其在结肠癌中的的生物学功能，为深入理解结肠癌的发生和发展开辟新的研究路径。
　　目的：在本研究中，我们首先检测miR-381在结肠癌组织和癌旁组织中的表达及与临床病理特征的关系，再进一步探讨miR-381对结肠癌细胞生长、增殖和侵袭的影响，然后预测并验证 miR-381的靶基因，阐明miR-381在结肠癌发生发展中的作用，为深入理解结肠癌发病的潜在分子机制和开发新的有效分子治疗靶点提供实验依据。
　　方法：通过RT-PCR方法，观察miR-381在不同临床分期的结肠癌组织及相应癌旁组织中的表达及与临床病理特征的关系；通过应用RNA干扰技术沉默miR-381表达，观察其对结肠癌细胞株生长、增殖及侵袭的影响，以及体内成瘤能力的影响；通过应用 miRNA靶基因预测软件TargetScan、miRanda和 miRWalk分析 miR-381的潜在靶基因，发现miR-381能够靶向结合LRH-13‘UTR的ACAUAUA序列，并通过双荧光素酶报告基因分析系统验证miR-381是否与之特异结合；再以人结肠癌细胞株SW480和HCT116为研究对象，应用miR-381沉默和miR-381过表达技术，观察其对结肠癌细胞株LRH-1表达的影响，进一步验证miR-381的靶点；通过应用 RNA干扰技术沉默 LRH-1表达，观察其对 miR-381抑癌作用的影响。
　　结果：本课题三部分的具体结果内容如下：
　　第一部分 miR-381在结肠癌组织和癌旁组织中的表达情况
　　本部分实验主要利用荧光定量RT-PCR方法观察miR-381在临床切除的结肠癌标本和癌旁组织中的表达情况。结果如下：
　　1 miR-381在结肠癌组织中表达情况
　　RT-PCR结果表明 miR-381在结肠癌组织中的相对表达水平（0.50±0.08）显著下调，是癌旁组织（1.00±0.13）的0.5倍，两者差异具有统计学意义。
　　2 miR-381与临床病理特征的关系
　　miR-381在20例III期和5例IV期结肠癌中的相对表达（0.28±0.06）水平明显低于3例I期和7例II期结肠癌（1.00±0.12）组织，P<0.001。并且miR-381的表达还与肿瘤浸润深度、组织学分化程度、远处转移等因素有关（P<0.05），而与患者性别、年龄因素无关，与淋巴结转移数量无关。
　　第二部分 miR-381对结肠癌细胞生长、增殖和侵袭能力的影响
　　本部分实验主要利用基因转染、MTT比色法、BrdU法、Transwell小室侵袭实验和体内成瘤的方法检测沉默miR-381后结肠癌细胞的生长、增殖和侵袭能力。结果如下：
　　1抑制miR-381对细胞在体外生长、增殖和侵袭的影响
　　为明确 miR-381下调在结肠癌中的作用，转染了其反义核苷酸至SW480和HCT116细胞，然后分析细胞的生长、增殖和侵袭能力。MTT比色法和BrdU掺入实验显示，抑制miR-381显著促进细胞的生长和增殖能力。此外，这两种细胞的浸润能力也明显增强。结果表明，下调miR-381能促进体外培养的结肠癌细胞生长、增殖和侵袭。
　　2抑制miR-381对肿瘤在裸鼠体内生长的影响
　　皮下注射经筛选并鉴定稳定过表达 miR-381反义核苷酸或阴性对照的SW480细胞至裸鼠前肢皮肤。结果，抑制miR-381明显促进小鼠体内癌细胞的生长，肿瘤的大小和重量显著增加。
　　第三部分 miR-381通过靶向LRH-1调控结肠癌细胞的生长、增殖和侵袭
　　本部分研究通过应用miRNA靶基因预测软件TargetScan、miRanda和miRWalk分析miR-381的潜在靶基因，发现miR-381能够靶向结合LRH-13‘UTR的ACAUAUA序列，并通过双荧光素酶报告基因分析系统验证miR-381是否与之特异结合；再以人结肠癌细胞株SW480和HCT116为研究对象，应用miR-381沉默和miR-381过表达技术以及Western blot实验，检测miR-381对靶基因LRH-1的调控作用，及沉默LRH-1表达后结肠癌细胞的生长、增殖和侵袭能力。结果如下：
　　1 miR-381在结肠癌细胞中的靶向调控基因
　　通过3个生物信息学软件，我们预测并鉴定了miR-381的调控靶标并揭示其潜在分子机制。编码肝受体类似物-1（LRH-1）的基因3‘UTR区域存在一个潜在的miR-381结合位点。Western blot实验表明，抑制miR-381导致SW480和HCT116细胞中LRH-1的蛋白水平增加。另外，过表达miR-381模拟物降低了这两种细胞中LRH-1的表达。因此，成功克隆了LRH-1基因的3‘-UTR非编码序列，为研究miR-381是否能与LRH-1基因的3‘-UTR非编码序列特异结合，我们进一步构建了突变型3‘-UTR非编码序列，分别插入荧光素酶报告基因载体。实验结果表明，抑制了miR-381表达的结肠癌细胞株增强了携带野生型3‘-UTR的荧光素酶活性，但不能增强携带突变型3‘-UTR的荧光素酶活性。
　　2沉默LRH-1对miR-381抑癌作用的影响
　　在SW480细胞中转染了LRH-1 siRNA后，内源性LRH-1基因表达沉默。LRH-1的内源性缺失抑制了miR-381反义核苷酸的促进细胞生长、增殖和侵袭的作用，提示LRH-1对miR-381在细胞生长、增殖和侵袭方面有非常重要的作用。
　　结论：综合上述三部分内容，本研究得出如下结论：
　　1 miR-381在人结肠癌组织中显著下调，miR-381的表达降低与结肠癌临床分期有关。
　　2体外和体内研究进一步表明，抑制 miR-381促进结肠癌细胞的生长、增殖和侵袭，同时促进裸鼠体内肿瘤的生长。
　　3 LRH-1是miR-381的靶基因，miR-381的下调在结肠癌的发生发展过程中起着重要的作用。
　　4 miR-381是结肠癌发生发展过程中一个重要的生物标志物，具有靶向LRH-1治疗癌症的潜能。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写

引言

第一部分miR-381在结肠癌组织中的表达情况

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分miR-381对结肠癌细胞生长、增殖和侵袭能力的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分miR-381通过靶向LRH-1调控结肠癌细胞的增殖和侵袭

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:MicroRNAs在结肠癌中的作用

致谢

个人简历