PNPLA3、TM6SF2基因多态性与吸烟、饮酒及交互作用对乙肝病毒相关性肝癌关联性的研究

摘要

目的：目前医学认为，癌症的发生和发展是一个复杂的过程，是遗传因素和环境因素及其相互作用产生的结果。含patatin样磷脂酶域3(patatin-l ike phospholipase domain containing3, PNPLA3)基因的作用是编码一个在肝细胞膜表达的跨膜蛋白，该蛋白具有调节脂质代谢、炎症介质等作用，研究发现该基因与肝脏炎症、肝纤维化进展有关，其位点rs738409与肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发生的相关性越来越受到重视。6号跨膜超家族2号(transmembrane6 superfamily member2， TM6SF2)基因主要编码跨膜蛋白，负责肝脏脂质代谢。一项研究表明其位点rs58542926影响非酒精性脂肪肝患者的肝纤维化程度，与肝硬化的发生有关。目前对TM6SF2基因与HCC关系的相关研究很少。因此本研究的遗传因素选择以上2个基因的rs738409、rs58542926位点。吸烟与饮酒是很多疾病的危险因素，对肝脏疾病的危害更是不容忽视，本研究选择吸烟、饮酒作为环境因素。分析遗传因素、环境因素与乙肝病毒相关性肝癌（hepatitis B virus hepato-cellular carcinoma，HBV-HCC）的关联，以及与乙肝病毒慢性感染不同结局的关系，并探讨两个基因之间及与吸烟、饮酒的交互作用与HBV-HCC的关联性。
　　方法：
　　1、候选基因的选取。利用 NCBI搜索关键词：single nucleotide polymorphism（单核苷酸多态性，SNP）hepatocellular carcinoma，从得到的文献中，对 2014 年后的相关英文文献进行查阅，得到相关候选基因PNPLA3、TM6SF2。在Hapmap（http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en) 项目数据库以及PubmedSNP数据库检索 PNPLA3、TM6SF2基因的位点信息，人种选择CHB(中国汉族人群Han Chinese in Beijing, China)。将从 HapMap 数据库中下载的 PNPLA3 基因 SNP 信息导入 Haploview 4.2 软件，利用Haploview4.2 软件对位点进行筛选，选择MAF（Minor Allele Frequency，最小等位基因频率)＞10％，r2(连锁不平衡系数)＞0.8，D’(连锁不平衡程度随距离而改变的程度)=1的位点，并在PubmedSNP数据库检索TM6SF2基因的位点信息，结合文献资料，最终选定 PNPLA3rs738409 位点与TM6SF2rs58542926位点。
　　2、样本收集 选择石家庄市四所三甲医院，共纳入2161人，其中慢性乙肝患者(Chronic hepatitis B，CHB)691 人，肝硬化患者(Liver cirrhosis, LC)680 人，乙肝病毒相关性肝癌患者(hepatitis B virus hepatocellular carcinoma, HBV-HCC)420人，健康体检者370人，同时获得研究对象的基线资料及临床检查结果。
　　3、基因分型 从外周血中提取 DNA ，运用美国 SEQUENOM 公司MassArray 时间飞行质谱技术进行基因分型，检测候选基因 PNPLA3、TM6SF2 的两个 SNP 位点（rs738409、rs58542926 ）的多态性。PNPLA3rs738409的基因多态性为CC、CG、GG，TM6SF2rs58542926的基因多态性为CC、CT、TT。
　　4、统计学处理 应用Epidata3.1软件建立数据库，在线SNP stats寻找基因多态性的最优赋值方法，SPSS20.0与SAS9.1进行数据的统计分析；采用拟合优度的?2检验进行哈代-温伯格（Hardy-Weinberg，H-W）平衡检验；采用多分类非条件logistic回归分析对疾病的相关基因多态性及吸烟与饮酒进行筛选，采用二分类logistic回归分析、叉生分析探讨基因-基因、基因-环境交互作用。二分类logistic回归?入=0.05，?出=0.10，H-W平衡检验?=0.10，其余?=0.05。
　　结果：1 一般情况健康组男性205人，女性165人；CHB组男性466人，女性225人；LC组男性470人，女性210人；HBV-HCC组男性326人，女性94人。进行?2检验，?2=45.223，P＜0.001，四组性别构成差异有统计学意义。CHB组和LC组在性别构成上差异无统计学意义（P=0.504），其它任何两组在性别构成上差异均有统计学意义。健康组、CHB、LC、HBV-HCC组男性构成比呈线性上升趋势（?2=42.910，P＜0.001 )。健康组年龄中位数为47岁，四分位间距22岁；CHB组分别为39岁和20岁。LC组为52岁和14岁；HBV-HCC组为57岁和12岁。K-W H 检验,X2=491.55，P＜0.001，四组人群平均年龄差异有统计学意义。四组间进行两两比较，LC组和HBV-HCC组平均年龄差异没有统计学意义，其余任两组之间平均年龄差异均有统计学意义；2H-W平衡检验健康者组 rs738409、rs58542926位点的基因型频率分布均符合 H-W平衡定律，?2值分别为1.402、1.546，P值均大于0.10。CHB组rs738409位点的基因型频率分布不符合 H-W平衡定律，X2=11.980，P＜0.005。除此以外，其他组两位点均符合H-W平衡检验；3 在线模型筛选分析LC+CHB 组与 HBV-HCC 组，rs58542926 选择共显性模型，赋值为CC=1，CT=2，TT=3。rs738409按有无突变进行赋值，CC=0，CG/GG=1；4 无序多分类logistic回归分析4.1 以健康组作为对照：CHB组：年龄每增加1岁，OR=0.951，95%CI(0.941，0.961) ，P＜0.001；男性与女性相比，OR=1.679，95%CI(1.241，2.273)，P＜0.001。LC组：年龄每增加1岁，OR=1.034，95%CI(1.022，1.045)，P＜0.001；男性与女性相比，OR=2.278，95%CI(1.684，3.082)，P＜0.001。HBV-HCC组：年龄每增加1岁，OR=1.076，95%CI(1.062，1.091)，P＜0.001；男性与女性相比，OR=3.002，95%CI(2.080，4.331)，P＜0.001 ；rs58542926每突变一个位点，OR=1.659，95%CI(1.026，2.684)，P=0.039。4.2 以CHB组作为对照：LC组：年龄每增加1岁，OR=1.087，95%CI(1.076，1.098)，P＜0.001；男性与女性相比，OR=1.356，95%CI(1.029，1.789)，P＜0.001；rs738409 CG/GG与CC相比，OR=0.751，95%CI(0.589，0.956)，P=0.020。HBV-HCC组：年龄每增加1岁，OR=1.132，95%CI(1.117，1.147)，P＜0.001；男性与女性相比，OR=1.787，95%CI(1.257，2.542)，P=0.001；饮酒与不饮酒相比，OR=1.680，95%CI(1.121，2.519)，P=0.012。4.3 以LC组作为对照：HBV-HCC组：年龄每增加1岁，OR=1.041，95%CI(1.029，1.054)， P＜0.001；饮酒与不饮酒相比，OR=1.539，95%CI(1.071，2.213)，P=0.020；吸烟与不吸烟相比，OR=1.453，95%CI(1.005，2.099)，P=0.047。5 交互作用分析健康者组和HBV-HCC组比较，未发现基因-基因、基因-环境、环境间的相加交互作用。LC+CHB组和HBV-HCC组比较：rs738409与rs58542926存在交互作用，为负交互相加模型，P=0.017。
　　结论：1、CHB、LC、HBV-HCC三组，男性构成比逐渐增大，平均年龄也逐渐增大。2、rs58542926的T突变是HBV-HCC的危险因素，rs738409的G突变是LC的保护因素。CHB为对照，饮酒可能是HBV-HCC的危险因素。以LC为对照，吸烟、饮酒可能是HBV-HCC的危险因素。3、乙肝病毒慢性感染后，rs738409 与 rs58542926 都突变时，可能是HBV-HCC的危险因素。

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中文摘要

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英文缩写

前言

材料与方法

1 研究对象

2 主要仪器及设备

3 电子数据库

4 实验方法

5 统计学方法

结果

1 研究对象一般情况

2H-W平衡检验

3 模型筛选

4 多分类logistics回归分析

5 交互作用分析

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: PNPLA3、TM6SF2基因与肝脏疾病关联性的研究

致谢

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