枯草芽孢杆菌BSD-2发酵条件及对黄瓜防病促生作用机理研究

摘要

枯萎病已成为影响黄瓜产量和品质的主要因素，长期使用化学农药进行防治，使病原菌抗药性增强、生态环境遭到破坏，限制了黄瓜产业的可持续发展。生物防治由于可以克服化学防治所带来的一系列弊端，越来越受到人们重视。植物内生细菌作为最具防病潜力与应用价值的一类有益微生物，不仅能够提高植物防病能力，还可以促进植物生长，增加产量。 在前期研究工作中分离到一株对黄瓜枯萎病具有高拮抗作用的内生枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)BSD-2，本文采用响应面法对其发酵培养基及发酵条件进行优化，并且对BSD-2促进植物生长、诱导植物抗病性机理，以及与其它有益微生物的混合作用进行了系统研究，以期为黄瓜枯萎病的生物防治和生防制剂的开发奠定工作基础。 枯草芽孢杆菌BSD-2分泌抗菌物质发酵条件的研究结果表明，液体发酵的最适培养基为：蛋白胨14.29g，淀粉14.07g，豆饼粉6.49g，CaCO32.0g，MgSO41.0g，水1000mL。最佳培养条件为：初始pH7.5，装液量为50 mL/250 mL，接种量为5％，30℃，200 r/min振荡培养38 h。 抑菌机理的初步研究表明，BSD-2菌株的发酵液能够有效抑制黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp cucumerinum)菌丝生长和孢子萌发，导致菌丝体膨大、原生质收缩、孢子不萌发或萌发异常；其挥发性代谢产物对菌丝生长也有抑制作用。 枯草芽孢杆菌BSD-2与木霉(Trichoderma viride)T28、放线菌(Actinomycetes) S317均对黄瓜种子萌发、根与植株的生长有显著的促进作用；不同程度的提高了其叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量。这为黄瓜生长提供了良好的生理基础，进而提高黄瓜的产量与品质。接种枯草芽孢杆菌BSD-2和镰刀菌的处理效果最好，增产18.5％。三种有益菌可明显提高土壤中的细菌和放线菌总量，真菌总量降低。其中BSD-2对细菌数量增加的效果最明显，在土壤中有一定的定殖能力。 枯草芽孢杆菌BSD-2可诱导黄瓜体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶、过氧化物酶(POD)等酶的合成，使PAL活性达到对照的3倍，β-1，3-葡聚糖酶的活性达到对照的4倍，几丁质酶活性达到对照的3倍，POD活性达到对照的1.6倍，提高了这些防御性酶的活性，表明BSD-2激活了黄瓜的防御反应，使黄瓜植株对黄瓜枯萎病菌的侵染产生强烈而快速的反应，从而抑制了病原菌的侵染。 枯草芽孢杆菌BSD-2与木霉T28或放线菌S317混合的实验结果表明，在黄瓜不同的生长时期，两种有益微生物与BSD-2具有协同增效作用，可以促进黄瓜生长，提高品质：但是并没有提高黄瓜防御性酶的活性，它们之间的相互作用关系，有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

1文献综述

1.1枯萎病的研究进展

1.1.1枯萎病的危害

1.1.2枯萎病病原菌的形态学研究

1.1.3枯萎病的治病机理

1.1.4枯萎病的生物防治现状

1.2内生细菌的生物学作用及其机制

1.2.1对植物的促生作用

1.2.2对植物病害的生物防治作用

1.3目前生物防治中出现的问题及其对策

1.3.1存在的问题

1.3.2解决对策

1.3.3展望

2枯草芽孢杆菌BSD-2发酵条件的研究

2.1材料

2.1.1菌种

2.1.2培养基

2.1.3主要仪器

2.2方法

2.2.1培养方法

2.2.2抑菌活性的检测方法

2.2.3培养基的优化

2.2.4发酵条件的优化

2.3结果与分析

2.3.1培养基的优化

2.3.2发酵条件的优化

2.4小结

3 BSD-2对黄瓜的防病促生作用的研究

3.1材料

3.1.1供试黄瓜品种

3.1.2供试菌株

3.1.3主要仪器

3.2方法

3.2.1促进黄瓜种子发芽与幼苗生长实验

3.2.2细胞分裂素的测定

3.2.3生长素的测定

3.2.4对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的影响

3.2.5对黄瓜枯萎病菌孢子萌发的影响

3.2.6挥发性代谢产物对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用

3.3结果与分析

3.3.1促进黄瓜种子发芽与幼苗生长实验

3.3.2细胞分裂素的测定

3.3.3生长素(IAA)的测定

3.3.4对黄瓜枯萎病菌丝生长的影响

3.3.5对黄瓜枯萎病菌孢子萌发的影响

3.3.6挥发性代谢产物对黄瓜枯萎病菌的拮抗作用

3.4.小结

4有益微生物对黄瓜生理指标以及根际微生物数量的影响

4.1材料

4.1.1供试黄瓜品种

4.1.2供试菌株

4.1.3供试培养基

4.1.4实验设计

4.1.5播种、接种及管理

4.2方法

4.2.1指标测定

4.3结果与分析

4.3.1形态指标

4.3.2生理指标

4.3.3根际微生物数量的变化

4.4 小结

5 BSD-2及其它有益微生物对黄瓜防御性酶活性的影响

5.1材料

5.1.1供试黄瓜品种

5.1.2供试菌株

5.2方法

5.2.1实验设计

5.2.2播种、接种及管理

5.2.3指标测定

5.3结果与分析

5.3.1枯草芽孢杆菌BSD-2 对黄瓜的诱导抗性

5.3.2复合微生物对黄瓜的诱导抗性

5.4小结

讨论

结论

参考文献

后记(含致谢)

攻读学位期间取得的科研成果清单