德氏乳杆菌乳酸亚种H-ATPase生理活性及其延迟发酵乳后酸化中的研究

摘要

发酵乳制品在保存过程中仍能进行缓慢发酵，酸度继续积累，导致发酵乳制品过酸味以及感官品质下降的后酸化(postacidification)现象发生。德氏乳杆菌乳酸亚种是发酵乳中最常用的发酵剂菌种之一，在发酵乳制品的后期保存中，因继续发酵产酸，成为引起发酵乳制品后酸化的主要原因。本项研究通过新霉素“加压”环境获得弱化H+-ATPase的德氏乳杆菌乳酸亚种菌株(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)，研究德氏乳杆菌乳酸亚种的H+-ATPase生理活性变化，探索其H+-ATPase生理活性与其发酵乳酸化活性间的相互关系，旨在为控制发酵乳品的后酸化发展，改善最终制品在贮存期间的风味及品质变化提供理论依据。主要研究结果如下: 1.采用含有新霉素(neomycin sulfate，400μg/mL)的改良MRS培养基，以德氏乳杆菌乳酸亚种(L.delbrueckii subsp.lactis,L5)为出发菌株，选育获得3株低活性H+-ATPase突变菌株5M6、5M1和5B1。以出发菌株L5为对照，突变株5M6、5M1和5B1的H+-ATPase活性分别下降了51.3％、27.7％和34.3％。新霉素敏感试验、菌株在MRS培养基37℃厌氧培养24h后的生物量及乳酸度数据显示，突变株5M6、5M1和5B1在转接8代后，这些指标变化不大，证实突变株的遗传性状稳定，可作为进一步的研究菌株。 2.以出发菌株L5为对照，对突变株5M6、5M1和5B1的生理学特性研究表明: ①无论以MRS还是脱脂乳作为培养介质，突变株5M6、5M1和5B1在细胞形态上均较出发菌株细长。 ②与出发菌株相比，突变株5M6、5M1和5B1的β-半乳糖苷酶活性明显降低，分别降为出发菌株的3.42％、2.56％和2.12％。 ③在MRS培养基中37℃(厌氧培养18h后，出发菌株L5的ATP含量明显低于突变株，其中，菌株L5的ATP含量约为0.63×10-18mol/个:突变株5M6和5B1的ATP含量分别为1.18×10-18mol/个和1.38x10-18mol/个；突变株5M1的ATP含量最高，约为1.60x10-18mol/个。 ④在pH4.2、5.2和6.2的MRS培养基中37℃厌氧培养24h后，与pH6.2相比较，在pH4.2时，突变株5M1、5M6和5B1的生物量较出发菌株L5明显降低。其中，突变株5M1、5M6和5B1分别下降了83.9％、73.6％和69.6％，出发菌株L5下降了52.0％。 ⑤在NaCl浓度为1％、3％和5％的MRS培养基中37℃厌氧培养24h后，与不加NaCl时相比较，NaCl浓度为5％时，突变株5M1、5M6和5B1的生物量下降明显高于出发菌株L5，其中，突变株5M1、5M6和5B1分别下降了94.1％、88.5％和79.7％，出发菌株L5下降了50.5％。 ⑥以脱脂乳作为培养介质，37℃厌氧培养48h后，接种出发菌株L5的发酵乳中的乳酸度为2.02％，培养介质的pH为3.28；接种突变株5M1、5M6和5B1的发酵乳的乳酸度分别为0.48％、0.76％和0.50％，pH分别5.40、5.22和4.52。这些数据显示，与出发菌株L5相比，突变株5M1、5M6和581酸化活性显著下降。 ⑦以出发菌株L5为对照，采用HPLC分析突变株5M6、5M1和5B1的氨基酸利用及代谢状况表明，在MRS培养基中37℃厌氧培养12h后，出发菌株L5转化谷氨酸到γ-氨基丁酸的比率为13.9％，明显低于突变株5M1、5M6和5B1的转化比率。其次，突变株间在转化谷氨酸到丫-氨基丁酸的比率上也存在差异，其中，突变株5M6转化比率最高，为16.7％；菌株5M1居中，为15.6％；菌株5Bl最低，为15.4％。当在MRS培养基中37℃厌氧培养18h后，4株菌转化谷氨酸到Y-氨基丁酸的比率均有提高，其中，出发菌株L5的转化率为15.1％，但明显低于突变株5M1、5M6和5B1的转化率；突变株5M6的转化率最高，为17.3％，突变株5B1居中，为17.O％，菌株5M1最低，为16.2％。 3.德氏乳杆菌乳酸亚种的H+-ATPase的酶学性质研究表明: ①该酶的分子量为126.0KD，最适反应时间为5min，最适反应温度为42℃，最适反应pH为7.5。ATP作为底物的最适添加量为3mmol/。 ②H+-ATPase活性受金属离子的影响，K+、Na+和Mg2+对H+-ATPase活性有促进作用，其中Mg2+的促进最明显，5M1、5M6、5B1和L5的H+-ATPase活力分别提高了107.0％、45.9％、163.0％和16.7％；Ba2+、Mn2+、Al3+和Li+离子对H+-ATPase活性有明显抑制作用，其中Al3+的制最明显，突变株5M1、5M6和5B1以及出发株菌L5的H+-TPase活力分别下降了76.0％、81.7％、60.4％和93.4％。 ③H+-TPase活性受特异性抑制剂DCCD的影响，DCCD浓度为60mmol/L时，H+-ATPase活性明显下降，出发菌株L5以及突变株5M6、5M1和5B1分别下降了87.6％、63.9％、32.8％和72.1％。 ④菌体在不同的培养时间，其H+-ATPase活性也不同。突变株5M1、5M6和5B1以及出发菌株L5的H+-ATPase活力均出现两个峰值，分别在8h和24h。培养8h后，突变株5M1、5M6和5B1以及出发菌株L5的H+-ATPase活力分别为0.25U、0.40U、0.24 U和4.55U，培养24h后，突变株5M1、5M6和5Bl以及出发菌株L5的H+-ATPase活力分别为0.18U、0.30U、0.19U和3.80U。 4.分别将出发菌株L5及突变菌株与嗜热链球菌菌株S(Streptococcus thermophilus S)两两搭配，按2％接种量分别接种到12％的巴氏灭菌脱脂乳中，42℃培养至凝乳并4℃冷藏至30d后的结果表明: ①无论是突变株还是出发菌株存在下，发酵乳的凝乳时间均在3.5～4h。4℃贮存5d，由菌株L5制备的发酵乳的滴定乳酸度为1.22％，pH为3.87；而由突变株5M1、5M6和5B1制备的发酵乳的滴定乳酸度分别为0.76％、0.76％和0.88％，pH分别为4.26、4.24和4.22。4℃贮存10d，由菌株L5制备的发酵乳的滴定乳酸度为1.35％，pH为3.75；由突变株5M1、5M6和5B1制备的发酵乳的滴定乳酸度分别为1.12％、1.17％和1.13％，pH分别为4.15、4.05和.4.08。显然，与对照菌株L5相比，采用突变株5M1、5M6和5B1制备的发酵乳品可以在规定的货架期内保持较低的酸度积累，推迟了发酵乳品后酸化出现的时间至少5d。 ②对4株菌的发酵乳感官评定表明，由突变株5M1、5M6和5B1制备的发酵乳风味口感方良好；SDS-PAGE证实，与对照菌株L5制备的发酵乳蛋白组分相比，由突变株5M6、5M1和511制备的发酵乳蛋白组分变化不大。③接种商业化的益生菌干粉制剂嗜酸乳杆菌NCFM(Lactobacillus acidophilusNCFM)到上述发酵乳中，4℃贮藏21d后，益生菌(NCFM)在L5制备的发酵乳的活菌数为9.0x107cfu/mL；在由突变株5M1、5M6和5B1制备的发酵乳中的活菌数均在10％cfu/L以上，分别为1.5×18Scfu/mL、1.3×108cfu/mL和1.5×108cfu.mL_。显然，采用弱化H+-ATPase活性的菌株来制备发酵乳，对于改善益生菌的存活效果也是非常有益的。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1 H+-ATPase的构成

1.1.1亚基构成及作用机理

1.1.2基因结构

1.2生理功能

1.2.1调控pH，增强细胞耐酸性

1.2.2促进物质运输

1.2.3促进能量转换

1.2.4调节渗透压，增强耐盐性

1.3 H+-ATPase的影响因素

1.3.1 H+-ATPase结构的影响

1.3.2 pH的影响

1.3.3温度的影响

1.3.4离子强度的影响

1.3.5其它影响因素

1.4 H+-ATPase与细胞生长代谢之间的关系及应用研究

1.5研究目标技术路线

2材料与方法

2.1试验菌株及来源

2.2培养基及培养条件

2.2.1 MRS培养基

2.2.2 12％的复原脱脂乳

2.2.3 M17培养基

2.2.4培养条件

2.3主要试剂及仪器设备

2.3.1重要试剂及材料

2.3.2仪器设备

2.4研究方法

2.4.1菌株的生理特征测试

2.4.2菌株的生化特性测试

2.4.3 16SrRNA基因的序列分析

2.4.4弱化H+-ATPase菌株的筛选

2.4.5 H+-ATPase活性测定

2.4.6生物量比较

2.4.7形态学特征比较

2.4.8 β-半乳糖苷酶活性测定

2.4.9 ATP含量测定

2.4.10发酵特性

2.4.11耐酸性

2.4.12耐盐性

2.4.13氨基酸吸收及转化(谷氨酸到γ-氨基丁酸)

2.4.14 H+-ATPase的分离纯化

2.4.15 H+-ATPase分子量的确定

2.4.16酶最佳反应时间

2.4.17酶最适反应温度

2.4.18酶的最适pH值

2.4.19金属离子对酶活力的影响

2.4.20培养时间对酶活力的影响

2.4.21特异性抑制剂(DCCD)对酶活力的影响

2.4.22弱化H+-ATPase菌株遗传稳定性试验

2.4.23弱化H+-ATPase菌株的应用研究

3结果与分析

3.1乳杆菌的鉴定结果

3.1.1乳杆菌的生理生化鉴定结果

3.1.2乳杆菌的16SrRNA基因序列分析的结果

3.2弱化H+-ATPase菌株的选育

3.2.1新霉素最低抑菌浓度(MIC)的测定

3.2.2新霉素抗性菌株的筛选

3.3测定H+-ATPase活性

3.3.1磷含量标准曲线

3.3.2蛋白质准曲线

3.4弱化H+-ATPase菌株的生理特性研究

3.4.1生物生长量

3.4.2形态学特征比较

3.4.3 β-半乳糖苷酶活性比较

3.4.4 ATP含量比较

3.4.5耐酵性比较

3.4.6耐盐性比较

3.4.7发酵特性比较

3.4.8氨基酸转化

3.5 H+-ATPase的分离纯化以及酶学性质研究

3.5.1 H+-ATPase酶分子量的确定

3.5.2酶的最佳反应时间

3.5.3酶的最适反应温度

3.5.4酶的最适pH值

3.5.5酶的最适添加底物(ATP)

3.5.6金属离子对酶活力的影响

3.5.7培养时间对酶活力的影响

3.5.8特异性抑制剂(DCCD)对酶活力的影响

3.6弱化H+-ATPase菌株的遗传稳定性试验

3.6.1 H+-ATPase活性比较

3.6.2新霉素(neomycin sulfate)敏感试验

3.6.3生物量以及pH值变化

3.7弱化H+-ATPase菌株的应用研究

3.7.1延迟发酵乳后酸化

3.7.2发酵乳的品质评定

3.7.3改善益生菌存活性

4讨论

4.1弱化H+-ATPase菌株的筛选

4.2 H+-ATPase活性的测定

4.3弱化H+-ATPase菌株的生理特性

4.3.1形态特征

4.3.2生物量

4.3.3生物发光法检测ATP含量

4.3.4耐酸性

4.3.5耐盐性

4.3.6氨基酸吸收及转化

4.4 H+-ATPase酶学性质研究

4.4.1反应时间的影响

4.4.2温度的影响

4.4.3 pH的影响

4.4.4金属离子的影响

4.4.5底物的影响

4.4.6培养时间的影响

4.4.7抑制剂的影响

4.5弱化H+-ATPase菌株的遗传稳定性

4.6弱化H+-ATPase菌株的应用研究

4.6.1延迟发酵乳后酸化

4.6.3发酵乳的感官评定

4.6.3改善益生菌存活性

4.8展望

5结论

参考文献

附录

作者简历

致谢