乳粉中常见致病菌多重荧光PCR检测方法的建立与应用研究

摘要

乳粉中常见的致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌，这三种食源性致病菌均具有很强的致病性，导致的食品安全问题引起世界范围内的广泛关注。传统方法操作繁琐，检测时间长，且灵敏度较低。本研究利用荧光定量PCR技术建立了一套多重荧光PCR检测沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的方法，缩短了检测时间，提高了灵敏度。
　　 本研究以沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因为靶基因，选择特异性引物，经过普通PCR扩增后，将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，产物胶回收纯化后连接到pMD18-T载体上，进行测序和比对，结果表明扩增产物的同源性为100％，从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。本研究对荧光PCR反应体系中退火温度、引物浓度进行了优化，以确定适宜荧光PCR反应体系和荧光PCR扩增程序。适宜反应体系为：12.5μLSYBR Premix Ex Taq(2×)，上、下游引物(各10μM)各0.5μL，2μ模版DNA，0.5μLDye，9μL灭菌双蒸水，总反应体系25μL;适宜扩增程序为：95℃30s，95℃5s，60℃31s（荧光信号采集阶段），从第二步到第三步重复40循环，95℃15s，60℃30s，95℃15s，（溶解曲线表达阶段）
　　 本研究建立了乳粉中多重荧光PCR检测沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的方法。
　　 比较了乳粉中粉中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌基因组DNA的3种提取方法的效果，结果显示试剂盒法优于CTAB/NaCl法和溶剂提取热裂解法。 人工污染样品，沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的检测限可以达到10-1，检测限低，且检测可在1个工作日内完成，检出时间短。
　　 对实际样品进行检测，将本研究建立的多重荧光PCR方法与国家标准GB4789.4-2010、GB4789.10-2010和GB4789.5-2003方法进行了比较，结果显示建立的多重荧光PCR方法敏感性为100％，特异性为99.0％，符合率为99.0％。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

1.1 研究背景及意义

1.2 乳粉中常见的致病菌

1.3 食源性致病菌检测研究现状

1.4 荧光定量PCR技术及应用

1.5 研究效益分析

1.6 研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌基因片段的PCR扩增

3.2 目的序列的测序鉴定

3.4 乳粉中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法的比较结果

3.5 荧光PCR检测乳粉中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌检出限的结果

3.5 实际检测结果

4 讨论

4.1 多重荧光PCR

4.2 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌特异性基因的选择

4.3 多重荧光PCR检测沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌

结论

参考文献

作者简历

致谢