常见食源性致病菌多重荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

食源性致病菌是能够引起食物中毒等食源性疾病的一类微生物，它们主要通过食物和水传播，在世界范围内广泛流行。食源性致病菌种类繁多，致病力强，严重威胁着人类的健康，而传统的细菌培养、生化分析、血清反应等方法已不能满足现代食源性致病菌快速、灵敏检测的要求。因此，建立一种更为有效的检测方法迫在眉睫。本研究利用TaqMan探针技术建立了检测水体和食品中常见的食源性致病菌的多重实时荧光定量PCR方法。
　　 确定沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、阪崎肠杆菌、单增李斯特氏菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌O157∶H7、大肠杆菌O104、大肠杆菌H4、霍乱弧菌O1和霍乱弧菌O139等12种食源性致病菌为检测对象。确定各菌的特异基因为靶基因，设计引物和TaqMan探针，最终建立了3组4重定量PCR体系。选取目标菌、近缘菌和非近缘菌共50株进行特异性验证实验，并用梯度稀释的基因组DNA和纯菌菌液检测其灵敏度。实验结果为:(1)该体系特异性良好，只有目标菌有阳性扩增信号产生;(2)灵敏度高，基因组DNA灵敏度为10-3～10-5 ng，纯菌灵敏度为101～103 CFUs/mL;(3)成功构建质粒标准品，绘制了11株菌的标准曲线;(4)用建立的多重定量PCR体系分别对饮用水、奶粉和蔬菜进行了实际检测，并将检测结果与16S rRNA测序结果进行比对，证明该体系的检测结果准确可靠。总之，本研究所建立的多重定量PCR方法特异性好、灵敏度高、检测范围广，可应用到临床疾病诊断，或是检验检疫部门对食品安全的日常监测中去。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 研究背景简介

1．1．1 常见食源性致病菌

1．1．2 食源性致病菌检测方法研究概况

1．1．3 多重荧光定量PCR检测方法研究现状

第二节 研究目标、内容和创新性

1．2．1 研究目标

1．2．2 研究内容

1．2．3 创新性

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 克隆用受体菌株

2．1．3 质粒

2．1．4 引物与探针

2．1．5 主要的酶与试剂

2．1．6 培养基和试剂配制

2．1．7 实验仪器

2．1．8 生物信息学软件

第二节 实验方法

2．2．1 菌株的培养

2．2．2 细菌基因组DNA的提取

2．2．3 荧光定量PCR引物和探针的设计

2．2．4 质粒标准品的制备

2．2．5 多重定量PCR体系建立

2．2．6 多重荧光定量PCR性能评价

2．2．7 标准曲线的绘制

2．2．8 模拟样品试验

2．2．9 实际样品试验

第三章 结果与分析

第一节 引物、探针的设计和筛选

第二节 多重定量PCR体系的建立

3．2．1 单重荧光定量PCR反应体系的优化

3．2．2 多重定量PCR反应体系的建立

第三节 多重定量PCR性能评价

3．3．1 特异性

3．3．2 灵敏度

3．3．3 双盲实验

第四节 标准曲线的绘制

3．4．1 重组质粒鉴定

3．4．2 标准曲线绘制

第五节 模拟样品和实际样品结果

3．5．1 样品处理方法研究

3．5．2 模拟样品试验

3．5．3 实际样品试验

第四章 讨论

第一节 关于靶基因的选择

第二节 关于引物和TaqMan探针

第三节 关于多重定量PCR体系

第四节 关于标准曲线

第五节 关于样品处理

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历