环介导等温扩增(LAMP)技术检测牛肉中大肠杆菌O157的研究

摘要

1885年,德国科学家T.Escherich首次发现大肠杆菌O157:H7,它是引起腹泻的重要致病菌。大多数食物中毒都可追溯到牛肉和未消毒的牛奶,而且感剂量小于100个细菌即可引起感染。目前对大肠杆菌O157:H7的检测方法主要有传统的常规培养法、免疫学检测方法和以PCR为代表的分子生物学检测方法。传统方法操作繁琐,检测时间长,而且灵敏度较低；免疫学检测方法特异性和灵敏度不理想；PCR方法敏感、快速,但由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程,难以在基层普及和推广。采用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,检测食品中的大肠杆菌O157:H7,具有灵敏度高,特异性强,检测方法简便,耗时短,检测成本低等特点,适宜在基层普及和推广。
　　 本研究针对大肠杆菌O157:H7(IQCC10102)rfbE保守序列(Genbank S83460),运用在线引物设计软件(http:／／primerexplorer.jp／e／index.html)设计LAMP引物。对BST酶添加量、dNTP浓度、镁离子浓度等扩增条件进行了优化,确定25μL的LAMP反应体系为:内引物(FIP和BIP)各1.6μM,外引物(F3和B3)各0.2μM,环引物(LB)0.8μM,0.6mM dNTP,3.0mM MgCl2,10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液,8U Bst DNA聚合酶大片段,1μL DNA模板和灭菌双蒸水。LAMP反应过程是:64℃水浴锅中反应20min,然后将其放入80℃水浴锅中,水浴10min终止反应,通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀,判断是否发生LAMP反应。
　　 为了比较LAMP检测大肠杆菌O157:H7灵敏度和人工污染的检出限,以PCR方法作对照。PCR引物是LAMP的两条外引物(F3和B3)。结果表明:LAMP检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度为9.8 CFU／mL,人工污染牛肉的检出限为68CFU／g。PCR检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度为980CFU／mL,人工污染牛肉的检出限为6.8x103CFU／g。采用试剂盒法提取DNA,从样品处理到报告结果,LAMP方法约耗时2h,PCR方法约耗时3h。利用LAMP方法对19株肠道致病菌进行特异性试验。结果表明:三株大肠杆菌O157为阳性,其他16株菌均为阴性。
　　 初步研究了3种模板制备方法对LAMP检测牛肉中大肠杆菌O157:H7的影响。结果表明,LAMP方法对制备模板DNA的要求不高。
　　 研究表明:LAMP技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测技术,在大肠杆菌O157:H7的快速检测方面有一定开发潜力,为快速检测食源性致病菌构建了一个新的技术平台。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

1.1 立题背景及意义

1.2 大肠杆菌O157:H7简介

1.2.1 大肠杆菌O157:H7生物学性状

1.2.2 大肠杆菌O157:H7的耐酸性和其主要毒力因子

1.2.3 大肠杆菌O157:H7的流行病学

1.2.4 大肠杆菌O157:H7的预防

1.3 大肠杆菌O157:H7的检测方法

1.3.1 常规培养法

1.3.2 免疫学检测方法

1.3.3 分子生物学检测方法

1.4 环介导等温扩增(LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION,LAMP)方法

1.4.1 LAMP方法的概述

1.4.2 LAMP方法的特点

1.4.3 LAMP方法的引物设计

1.4.4 LAMP方法的基本原理

1.4.5 LAMP的反应体系

1.4.6 LAMP反应产物的检测方法

1.4.7 LAMP方法的应用

1.5 研究内容

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验菌株

2.1.2 仪器与设备

2.1.3 主要培养基

2.1.4 样品与生化试剂

2.2 试验方法

2.2.1 大肠杆菌O157:H7的培养

2.2.2 大肠杆菌O157:H7基因组DNA的提取

2.3 引物设计、体系和操作程序

2.3.1 LAMP引物设计

2.3.2 LAMP和PCR反应体系

2.3.3 LAMP和PCR操作程序

2.4 LAMP反应条件优化

2.4.1 引物对LAMP反应的影响

2.4.2 最适Mg2+浓度选择

2.4.3 dNTP浓度的优化

2.4.4 反应温度的优化

2.4.5 BST酶的优化

2.5.6 反应时间的优化

2.5 引物特异性试验

2.5.1 LAMP引物特异性试验

2.5.2 PCR引物特异性试验

2.6 LAMP扩增产物的分析

2.6.1 LAMP产物的可视结果分析

2.6.2 LAMP产物的电泳分析

2.6.3 LAMP产物酶切结果分析

2.7 大肠杆菌O157:H7纯培养灵敏度的研究

2.7.1 LAMP检测大肠杆菌O157:H7纯培养的灵敏度

2.7.2 PCR检测大肠杆菌O157:H7纯培养的灵敏度

2.8 人工污染牛肉中大肠杆菌O157:H7基因组DNA提取方法的比较

2.8.1 普通热裂解法

2.8.2 酚-氯仿抽提法

2.8.3 试剂盒法(UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒)

2.9 人工污染牛肉的检出限

2.9.1 LAMP检测人工污染牛肉的检出限

2.9.2 PCR检测人工污染牛肉的检出限

3 结果与分析

3.1 LAMP反应条件优化

3.1.1 引物对LAMP反应的影响

3.1.2 最适Mg2+浓度选择

3.1.3 dNTP浓度的优化

3.1.4 反应温度的优化

3.1.5 BST酶的优化

3.1.6 反应时间的优化

3.2 引物特异性试验

3.2.1 LAMP引物特异性试验

3.2.2 PCR引物特异性试验

3.3 LAMP扩增产物的分析

3.3.1 LAMP产物的可视结果分析

3.3.2 LAMP产物的电泳分析

3.3.3 LAMP产物酶切结果分析

3.4 大肠杆菌O157:H7纯培养灵敏度的研究

3.4.1 LAMP检测大肠杆菌O157:H7纯培养的灵敏度

3.4.2 PCR检测人肠杆菌O157:H7的灵敏度

3.5 人工污染牛肉中大肠杆菌O157:H7基因组DNA提取方法的比较

3.6 人工污染牛肉的检出限

3.6.1 LAMP检测人工污染牛肉的检出限

3.6.2 PCR检测人工污染牛肉的检出限

4 讨论

4.1 靶基因的选择

4.2 引物的确定

4.3 DNA聚合酶

4.4 污染防治措施

4.5 LAMP反应程序优化

5 结论

参考文献

附录 A

硕士期间发表学术论文

作者简介

致谢