实时荧光单引物等温扩增技术检测克罗诺杆菌的研究

摘要

克罗诺杆菌（Cronobacter）是一种普遍存在于自然环境中的条件致病菌，不但存在于被污染的食品和食品工厂中，还几乎能够从所有的环境中分离得到。感染克罗诺杆菌的高危人群是婴幼儿，死亡率高达20％～50％，幸存下来的婴幼儿也可能导致严重的神经系统后遗症。因此，建立一种在婴幼儿奶粉中快速、灵敏、高效、可靠的检测克罗诺杆菌的方法是至关重要的。
　　实时荧光单引物等温扩增技术(RF-SPIA)是以单引物等温扩增技术(SPIA)为理论依据，将荧光染料与SPIA技术相结合，利用恒温扩增实时荧光检测系统(DEAOUARTⅡ)，将实时荧光监测仪与电脑相连，通过荧光信号的积累，实时监测反应进程，可自动判定反应结果的阴性与阳性，并生成反应结果图。
　　根据克罗诺杆菌在GenBank中16S rRNA基因(HQ880288.1)，利用软件PrimerPremier5.0、DNAMAN设计RF-SPIA引物及Blocker，对反应体系中各添加物条件进行优化，确定25μL的RF-SPIA的反应体系:25 mmol/L MgSO40.8μL，10 mmol/LdNTPs2.0μL，10μmol/L引物2.0μL，2×BcaDNA聚合酶缓冲液2.0μL，5×RNaseH缓冲液1.5μL，40 U/μL核糖核酸抑制剂0.6μL，20 mg/mL Bovine Serum Albumin0.9μL，10μmol/L Blocker1.0μL，20 U/μL BcaDNA聚合酶1.0μL，60 U/μL RNaseH0.6μL，模板1.0μL，SYBR GreenⅡ(1∶400)1.0μL，RNase-free Water补足反应体系。RF-SPIA反应程序:扫描频率为60 s一次，反应温度为61℃，反应时间120 min（通过观察反应情况随时停止）。
　　本研究以15株克罗诺杆菌和29株非克罗诺杆菌作为试验菌株进行RF-SPIA试验的引物特异性验证，发现阳性结果均为克罗诺杆菌株，其余非克罗诺杆菌菌株结果均显示阴性，由此证明试验所设计的引物特异性高，可用于克罗诺杆菌的检测。本试验对克罗诺杆菌纯培养的灵敏度达到1.4×100 CFU/mL，对克罗诺杆菌基因组的灵敏度达到7.5×101 fg/mL，将克罗诺杆菌人工污染婴幼儿配方奶粉，并测定其检出限达到8.1×102 CFU/g。通过离心沉淀及紫外照射，试验结果可用肉眼直接观察。
　　本研究所建立的实时荧光单引物等温扩增技术检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌的方法特异性强、灵明度高，方便快捷，还可肉眼观察结果。该检测方法不需要繁琐的电泳过程，操作简单，为快速检测食源性致病菌建立了一个技术平台，更利于基层检验检疫机构的应用。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 立题背景及意义

1．2 克罗诺杆菌简介

1．2．1 克罗诺杆菌的发现

1．2．2 克罗诺杆菌的生物学特征

1．2．3 克罗诺杆菌的致病因素

1．2．4 克罗诺杆菌的流行情况

1．3 克罗诺杆菌鉴定检测方法研究现状

1．3．1 传统培养检测方法

1．3．2 免疫学检测方法

1．3．3 分子生物学检测方法

1．4 单引物等温扩增技术

1．4．1 SPIA概述

1．4．2 SPIA技术原理

1．4．3 SPIA技术要点

1．4．4 SPIA技术优点

1．5 实时荧光单引物等温扩增技术(RF-SPIA)

1．5．1 实时荧光单引物等温扩增技术原理

1．5．2 荧光染料SYBR Green Ⅱ

1．5．3 实时荧光监测仪

1．6 本课题研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验用菌株

2．1．2 仪器设备

2．1．3 试验用培养基

2．1．4 样品与生化试剂

2．2 试验方法

2．2．1 菌种的培养

2．2．2 细菌DNA模板的提取

2．3 RF-SPIA方法的建立

2．3．1 RF-SPIA反应引物设计

2．3．2 RF-SPIA反应体系和主要操作程序

2．4 RF-SPIA反应条件优化

2．4．1 适宜Mg2+浓度选择

2．4．2 适宜dNTPs浓度优化

2．4．3 适宜引物浓度优化

2．4．4 适宜BcaDNA聚合酶缓冲液(Bca Buffer)添加量优化

2．4．5 适宜RNaseH缓冲液(Hybrid RNA Degeneration Buffer)添加量优化

2．4．6 适宜核糖核酸抑制剂(Recombinant RNase Inhibitor)浓度优化

2．4．7 适宜Bovine Serum Albumin(BSA)浓度优化

2．4．8 适宜Blocker浓度优化

2．4．9 适宜BcaDNA聚合酶(BcaBEST Polymerase)添加量优化

2．4．10 适宜核糖核酸内切酶(RNaseH)添加量优化

2．4．11 荧光染料对RF-SPIA的影响

2．4．12 反应温度的优化

2．5 RF-SPIA扩增产物的结果分析

2．5．1 RF-SPIA扩增产物的实时荧光曲线分析

2．5．2 RF-SPIA扩增产物的可视结果分析

2．6 引物特异性的检测

2．7 克罗诺杆菌的灵敏度检测

2．7．1 RF-SPIA检测克罗诺杆菌纯培养的灵敏度

2．7．2 RF-SPIA检测克罗诺杆菌基因组灵敏度

2．8 人工污染奶粉中克罗诺杆菌的检出限

2．8．1 人工污染奶粉克罗诺杆菌及基因组DNA的制备

2．8．2 RF-SPIA法检测人工污染克罗诺杆菌样品的检出限

3 结果与分析

3．1 RF-SPIA反应条件优化

3．1．1 Mg2+浓度的优化

3．1．2 dNTPs浓度的优化

3．1．3 引物浓度的优化

3．1．4 Bca Buffer添加量的优化

3．1．5 Hybrid RNA Degeneration Buffer添加量的优化

3．1．6 Recombinant RNase Inhibitor浓度的优化

3．1．7 BSA浓度的优化

3．1．8 Blocker浓度的优化

3．1．9 BcaBEST Polymerase添加量的优化

3．1．10 RNaseH添加量的优化

3．1．11 荧光染料对RF-SPIA的影响

3．1．12 反应温度的优化

3．2 RF-SPIA体系扩增结果分析

3．2．1 RF-SPIA体系扩增的实时荧光曲线分析

3．2．2 RF-SPIA体系扩增产物的可视分析

3．3 引物特异性的研究

3．4 克罗诺杆菌的灵敏度检测

3．4．1 RF-SPIA检测克罗诺杆菌纯培养的灵敏度

3．4．2 RF-SPIA检测克罗诺杆菌基因组的灵敏度

3．5 人工污染奶粉中克罗诺杆菌的检出限

4 讨论

4．1 对RF-SPIA检测克罗诺杆菌的方法学评价

4．2 RF-SPIA引物及Blocker的设计

4．3 RF-SPIA反应条件的优化

4．4 今后研究的重点及应用开发注意事项

5 结论

参考文献

攻读学位论文期间发表论文情况

作者简介

致谢